c-Jun拮抗剂肽

本发明涉及拮抗c-jun的肽，编码拮抗c-jun的肽的核酸，包含拮抗c-jun的肽的药物制剂，以及拮抗剂肽在治疗c-jun介导的疾病中的用途。

背景技术：

1、转录因子(transcription factor，tf)在决定细胞功能和命运中发挥至关重要的作用。一系列上游信号汇聚在tf上，通过特定的dna位点识别将重要的细胞信号传导过程转化为转录输出。因此，在人基因组中的约1600个tf中，>300个与疾病表型相关。tf功能障碍导致一系列有害结局，包括癌症、糖尿病和心血管疾病(lee et al.，2013；lambert etal.，2018)。因此，选择性tf拮抗作用是用于治疗这些疾病的令人信服的治疗途径。

2、c-jun是涉及一系列人疾病的转录因子(eferl et al.，2003；yung et al.，2010；shiozawa et al.，2009)。c-jun是二聚体转录因子激活蛋白-1(activator protein-1，ap-1)家族的成员。ap-1蛋白通过其碱性亮氨酸拉链(basic-leucine zipper，bzip)结构域与dna识别元件结合，所述碱性亮氨酸拉链结构域由促进二聚化的亮氨酸拉链(leucinezipper，lz)和促进dna序列识别的dna结合结构域(dna-binding domain，dbd)组成(gloveret al.，1995；risse et al.，1989)。c-jun与12-o-十四烷酰佛波-13-乙酸酯响应元件(12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate response element，tre)结合，直接影响细胞过程，例如分化、增殖和存活(shaulian et al.，2001；eferl et al.，2003；eckert et al.，2013；alani et al.，1991)。因此，这些功能的失调促进了标志性的癌细胞行为，使cjun成为癌症治疗的焦点。

3、tf功能依赖于蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，ppi)和蛋白质-dna相互作用，这些相互作用在其大表面上形成许多接触点。小分子(smallmolecule，sm)由于缺乏易处理的口袋通常无法消除这些类型的相互作用。

4、虽然平面上的蛋白质-蛋白质相互作用对于许多药物(包括小分子)是不可及的，但当肽被设计成补充广泛的靶表面时，其具有作为高亲和力和选择性抑制剂的优异潜力。多种方法已经产生了靶向广泛的lz结合界面的肽c-jun拮抗剂(boysen et al.，2002；mason et al.，2006；kaplan et al.，2014；baxter et al.，2017；lathbridge et al.，2018)。然而，难以预测lz结合是否将转化为功能性拮抗作用，因为cjun dbd保持未结合并且能够结合tre dna(seldeen et al.，2008；szalóki et al.，2015)。合理设计的肽已显示出靶向c-jun dbd，但是表现出比lz拮抗剂更低的效力，并且由于ap-1家族dbd之间的高度序列相似性而引起对特异性的担忧(tsuchida etal.，2004)。

5、规避现有方法潜在缺点的一种方法是利用较长的肽，该较长的肽以选择性但高亲和力的相互作用靶向完整的c-jun bzip结构域，同时阻断dna结合和lz二聚化二者。oliveet al.采用这种方法来产生a-fos，其组合了野生型(wild-type，wt)cfos lz(已知与c-jun异二聚化)和合理设计的富含glu的酸性延伸部(olive et al.，1997)。a-fos设计原理假设lz相互作用在n端延伸，产生通过将leu残基并入到酸性延伸部中的推定d位置中而促进的dbd-酸性延伸部相互作用。

6、对于将能够充当功能活性c-jun拮抗剂的肽，它们不仅必须与c-jun结合，而且靶标结合还必须导致功能的消除。一种最近描述的鉴定转录因子的功能性拮抗剂的方法是wo2020128015中描述的转录阻断存活(transcription block survival，tbs)测定。

7、仍然需要充当功能性拮抗剂的c-jun拮抗剂，尤其是那些表现出用于治疗用途的可期望药代动力学特性的c-jun拮抗剂。

8、根据上述考虑设计了本发明。

技术实现思路

1、本发明人已经鉴定了新的肽抑制剂，其被证明结合c-jun并拮抗其dna结合功能。

2、在本发明之前的工作中，本发明人使用了基于文库的方法，其中跨越c-jun拮抗剂的酸性延伸部和亮氨酸拉链区的铰链区是半随机化的。在该支架上产生肽文库，并将其在残基的中央段(central tract)中进行随机化，并使用tbs筛选平台进行测试。这导致从约130，000个肽的文库中鉴定出重组产生的功能性c-jun拮抗剂，称为“hingew”。在该实施例中，证明了hingew与hingew所来源的c-jun拮抗剂相比优先与c-jun结合且具有更高的亲和力，并且有效地拮抗c-jun/tre dna相互作用。c-jun的宽、浅的螺旋结合表面的性质支持使用较长的肽，例如通过tbs鉴定的肽。

3、bzip拮抗剂的结合表位存在于单个α-螺旋的一侧，并且因此靶标结合需要肽采用这种二级结构。认识到开发治疗性肽的基本步骤是将肽缩小至达到有效结合所需的最小功能单位，本发明人在鉴定的拮抗剂肽中引入了迭代截短。缩小倾向于降低肽的α-螺旋度，因为相互作用界面和延伸的内部氢键网络二者都变得减少，并且水竞争这些相互作用，使折叠平衡转向无规卷曲(random coil)。因此，将肽缩小以提高药物样特征(例如稳定性和膜渗透性)需要与由肽的α-螺旋度降低导致的亲和力降低相平衡。如本文中所表明的，开发了在改善了肽的药物样特征的同时保留了功能活性的hingew肽的多种优化和截短形式。

4、在第一方面中，本发明提供了c-jun拮抗剂，其包含具有氨基酸序列的延伸的铰链区；和在该延伸的铰链区的c端的亮氨酸拉链(lz)区，

5、其中：

6、x1选自v、d、k、c和r，

7、x2选自d、k、c和r，

8、x3选自v、d、c、k和r，并且

9、x4选自e、d、c、k和r。

10、在一些实施方案中：

11、x1选自v、d、k和c，

12、x2选自d、k和c，

13、x3选自v、d和c，并且

14、x4选自e、d和c。

15、在一些实施方案中，延伸的铰链区还包含具有氨基酸序列的n端酸性延伸部，

16、其中：

17、x5选自e、k或c，并且

18、x6选自e或d。

19、在一些实施方案中，酸性延伸部具有氨基酸序列

20、在一些实施方案中，x1是v。在一些实施方案中，x3是v。在一些实施方案中，x1和x3是v。

21、在一些实施方案中：

22、(i)x1是v，x2是d，x3是v并且x4是e；

23、(ii)x1是v，x2是k，x3是v并且x4是d；或者

24、(iii)x1是v，x2是c，x3是v并且x4是c。

25、在一些实施方案中，lz区域包含氨基酸序列或其中

26、[x7]是k、l、s、w、p、q、r、m、t、v、a、e或g；

27、[x8]是i、v或l；

28、[x9]和[x10]是任意氨基酸残基。

29、[x11]是q、e或k。

30、在一些实施方案中，lz区包含选自以下的氨基酸序列：

31、

32、或者其含有1、2或3个氨基酸修饰的变体。

33、在一些实施方案中，lz区包含选自以下的氨基酸序列：

34、

35、或者其含有1、2或3个氨基酸修饰的变体。

36、在一些实施方案中，lz区包含：氨基酸序列或者其含有1、2或3个氨基酸修饰的变体，

37、任选地其中变体中对应于seq id no:7的第16位(七肽中的第b位)和第20位(七肽中的第f位)的位置处的氨基酸残基分别是k和d氨基酸残基。

38、在一些实施方案中，lz区包含：氨基酸序列或者其含有1、2或3个氨基酸修饰的变体，

39、任选地其中变体中对应于seq id no:27的第16位(七肽中的第b位)和第20位(七肽中的第f位)的位置处的氨基酸残基均是c氨基酸残基。

40、在一些实施方案中，c-jun拮抗剂的长度为30至70个氨基酸、30至60个氨基酸、30至50个氨基酸或30至40个氨基酸。在一些具体实施方案中，c-jun拮抗剂的长度为36个氨基酸。

41、在一些实施方案中，c-jun拮抗剂具有以下的氨基酸序列：

42、

43、或者其含有1、2、3个氨基酸修饰的变体。

44、在一些实施方案中，c-jun拮抗剂包含至少一个共价的氨基酸残基交联剂。这样的肽在本文中可称为“螺旋约束的c-jun拮抗剂”。在一些实施方案中，c-jun拮抗剂肽包含至少一个共价的i至i+4或i至i+7氨基酸残基交联剂。如本文中所表明的，引入共价的氨基酸残基交联剂提高了螺旋度，并且可提高肽的拮抗剂活性。这是有益的，因为它可用于获得这样的功能活性肽拮抗剂：其具有与亲本蛋白相似的结合亲和力和功能，具有赋予特异性的相同氨基酸序列，同时保持类似于小分子治疗剂的稳定性和溶解性。虽然对于作为交联剂的k至d内酰胺桥证实了这一点，但是如果使用其他交联剂，例如通过胱氨酸烷基化在两个c残基之间形成的烷基交联(例如dbmb)，则预期具有类似的结果。

45、在一些实施方案中，c-jun拮抗剂肽包含至少一个共价的i至i+4氨基酸残基交联剂。例如，c-jun拮抗剂肽可包含两个共价的i至i+4氨基酸交联剂。优选地，共价的i至i+4交联剂存在于七肽第b至f位或f至c位处。优选地，共价的i至i+4氨基酸交联剂是k至d内酰胺桥，或者是在两个c残基之间形成的烷基交联(半胱氨酸烷基化)。

46、在第二方面中，本发明提供了编码根据本发明第一方面的c-jun拮抗剂肽的核酸。

47、在第三方面中，本发明提供了缀合物，其包含与脂质、聚合物或第二肽缀合的根据本发明第一方面的c-jun拮抗剂肽。

48、在第四方面中，本发明提供了药物组合物，其包含与生理学上可接受的赋形剂或载体组合的根据本发明第一方面的c-jun拮抗剂、根据本发明第二方面的核酸或根据本发明第三方面的缀合物。

49、在第五方面中，本发明提供了根据本发明第一方面的c-jun拮抗剂肽、根据本发明第二方面的核酸、根据本发明第三方面的缀合物或根据本发明第四方面的药物组合物，其用作药物。

50、在第六方面中，本发明提供了抑制c-jun的方法，所述方法包括在体外向包含或表达c-jun肽的细胞施用根据本发明第一方面的肽、根据本发明第二方面的核酸或根据本发明第三方面的缀合物。

51、本文中还提供了产生根据本发明第一方面的c-jun拮抗剂肽的方法。产生c-jun拮抗剂肽的方法可包括使用固相或液相肽合成来合成c-jun拮抗剂肽，或者可包括通过重组表达来产生c-jun拮抗剂肽。该方法还可包括使c-jun拮抗剂肽与交联剂接触以产生螺旋约束的c-jun拮抗剂肽。本文中另外提供了产生螺旋约束的c-jun拮抗剂肽的方法，其包括使根据本发明第一方面的c-jun拮抗剂肽与交联剂接触。

52、本发明包括所述方面与优选特征的组合，除明显不允许或明确避免这样的组合的情况之外。

53、下文更详细地描述了本发明的这些和其他方面。