用于产生具有单链粘端的双链DNA片段的异源双链体热稳定性连接组装(HTLA)和/或环状异源双链体热稳定性连接组装(CHTLA)

本发明涉及一种在以双链为主的dna分子中产生具有使用者定义的长度和序列的单链突出端(粘端)的方法，其中所述方法与限制性核酸内切酶和dna核酸外切酶活性无关，并且其中所形成的异源双链体dna是使用dna连接酶通过一次或多次连接来接合的，最终结果为产生具有单链突出端的双链dna片段，以用于接合和产生具有可变区选择的更大的线性或共价闭合环状dna分子。相关技术在现有技术中，通过使用基于限制性酶的克隆，已经实现了以有序的方式组装多个dna片段，然而，该过程往往因相容的且适当定位的限制性酶位点的可用性而受到严重限制。所有的体外有序组装方法都需要互补的单链dna (粘性)内聚末端来指导dna片段的顺序。方法的主要区别在于产生粘端的方法及其长度。例如，常规dna克隆中所使用的大部分ii型限制性核酸内切酶识别回文序列，并在双链dna的回文序列内切割磷酸二酯键，留下交错的内聚(粘性)末端，从而留下最多五个核苷酸长的突出端。为了实现有序组装，每个待接合的dna片段都必须具有例如由不同的限制性核酸内切酶的酶活性产生的独特粘端。在实践中，可以以这种方式接合以便在质粒载体中产生环状dna的片段数量通常被认为少于十(10)个。iis型限制性核酸内切酶识别特异性dna序列(其可能是或可能不是回文序列)，然后在远离任何dna序列内的识别位点的精确距离处切割，并且产生不超过五个核苷酸且最通常为四个核苷酸的短粘端。例如，iis型限制性核酸内切酶形成了所谓的金门克隆的基础。鉴于四个核苷酸的突出端有256种可能的迭代，理论上，单锅金门反应中可以以有序的方式接合多达128个dna片段。然而，鉴于dna连接酶接受并连接一些具有不完全沃森-克里克碱基配对序列的粘端，实际极限为24个片段。另一种著名的组装技术称为吉布森组装，它基于同源性并且使用噬菌体核酸外切酶，即t5和t7核酸外切酶来产生部分单链的dna分子。然而，由于有序阵列中能够接合的片段数量通常被认为少于20个，因此使用吉布森组装是有限制的。为了克服以往组装技术的缺点，本发明提供了不受接合片段数量限制的产生dna组装体的更有效的高保真度技术。

背景技术：

0、发明背景

技术实现思路

1、本发明提供了一种有效的dna组装方法，所述方法由一个至数千个核苷酸产生具有使用者定义的序列和长度的连接即用型单链突出端，从而形成具有5'或3'突出端的异源双链体dna，即，通过被称为异源双链体热稳定性连接酶组装(htla)方法的本发明方法产生粘端dna分子，所述方法由双链或单链dna前体分子形成了线性或闭合环状dna分子，并且当所述方法通过被称为环状异源双链体热稳定性连接酶组装(chtla)的方法从双链dna前体开始进行多于一个循环时，形成了具有粘端的线性dna分子、环状dna分子和/或钝端线性dna分子的混合物，而当chtla从单链前体开始进行时，仅形成了具有粘端的线性dna分子和/或环状dna分子。在本文中，我们将“异源双链体”dna分子定义为以双链为主的分子，其中“顶部”链来源于一个双链或单链前体dna分子，“底部”链来源于一个不同的双链或单链dna分子，二者在互补dna链的被称为退火或杂交的过程中通过沃森-克里克碱基配对接合。

2、在一个方面，本发明提供了一种形成具有5'或3'突出端的粘端块(seb)的方法，所述方法包括：

3、提供至少三个前体单链、双链dna片段或其混合物，经设计使其正确地组装，以产生所定义的dna序列；

4、将所述至少三个前体dna片段引入缓冲介质中；

5、在熔融温度下施加热，致使所述至少三个前体dna片段熔融；以及

6、在存在热稳定性连接酶的情况下降低熔融温度以进行退火，从而产生了通过并置在dna末端的互补区域的碱基配对而形成的异源双链体双链dna，然后连接所述异源双链体双链dna，从而产生单链末端具有5'或3'突出端的新的更大的双链dna产物，称为粘端块(seb)，或者在seb的末端上的突出端互补的情况下，产生共价闭合环状dna。

7、如本文中所使用的前体dna片段选自双链dna分子、单链dna分子或二者的混合物。所述dna片段内的核苷酸碱基可以是天然的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或其任何化学修饰形式，它们可以通过化学合成或酶(即，dna聚合酶)的作用并入dna分子中，或者可以在合成后通过化学或酶促方式出现在一个或多个碱基中。

8、上述形成具有5'或3'突出端的粘端块(seb)的方法包括将前体dna片段和热稳定性dna连接酶引入缓冲介质中，所述缓冲介质包含用于维持ph的缓冲液，例如tris-hcl、mgcl2、kcl、nad、dtt和triton x-100，并且ph为约4.0至约10，优选为约6至10，更优选为约7.5至约9。所述熔融温度可以在约37℃至100℃的范围内，更优选高于60℃，其中用于熔融的时间段在约30秒至约10分钟的范围内，更优选为1至5分钟。退火通过将温度降至比熔融温度低5℃至60℃，更优选降至比熔融温度低约10℃至40℃来进行，并且用于该退火步骤的时间段为约30秒至10分钟，更优选为约4分钟至6分钟。

9、此外，为了产生seb和钝端dna的混合物，上述方法可以采用双链dna前体并重复多次，例如至少2次至12次以上。注意，在第2个循环之后的各个循环中，所形成的钝端产物也可能有助于形成所期望的seb。

10、在另一个方面，本发明提供了一种形成具有5'或3'突出端的粘端块(seb)的方法，所述方法包括：

11、提供至少三个前体单链、双链dna片段或其混合物，经设计使其正确地组装，以产生所定义的dna序列；

12、将所述至少三个前体dna片段引入ph为约7.5至约9且包含tris-hcl、mgcl2、kcl、nad、dtt和triton x-100的缓冲介质中；

13、在使所述至少三个前体dna片段熔融的温度下施加热，其中用于熔融的温度由所述序列的大小决定并且可以在约37℃至100℃的范围内，加热时间段为30秒至10分钟；以及

14、在存在热稳定性连接酶的情况下降低温度以退火，其中退火在比用于熔融的温度低10℃至40℃的温度下进行并且持续在4分钟至10分钟范围内的时间段，从而产生了通过使具有单链末端的互补区域进行碱基配对而形成的异源双链体双链dna，从而形成了具有5'或3'突出端的粘端块。

15、另外，所述前体dna片段可以包含一个或多个随机或可变核苷酸。此外，在上述反应中未消耗的任何前体双链dna片段都可以在退火后重新形成。如下文所讨论，如果进行了多于一个加热、退火和连接的循环，则除了新的seb产物之外，还形成了新的钝端产物。

16、此外，所述缓冲介质可以包括单链结合蛋白，酶如dna解旋酶或拓扑异构酶等，一种或多种拥挤剂，金属离子，清洁剂，或其它促进dna链退火的剂。

17、在另一个方面，本发明提供了一种形成环状异源双链体dna的方法，所述方法包括：

18、提供至少三个前体dna片段，经设计使其正确地形成一个或多个seb，所述seb组装产生所定义的共价闭合环状dna序列；

19、将所述至少三个前体dna片段引入ph为约7.5至约9且包含tris-hcl、mgcl2、kcl、nad、dtt和triton x-100的缓冲介质中；

20、在使所述至少三个前体dna片段熔融的温度下施加热，其中用于熔融的温度由所述序列的大小决定并且可以在约60℃至100℃的范围内，加热时间段为30秒至10分钟；

21、在存在热稳定性连接酶的情况下降低温度以退火，其中退火在比用于熔融的温度低5℃至40℃的温度下进行并且持续在1分钟至10分钟范围内的时间段，从而产生了通过使具有单链末端的互补区域进行碱基配对而形成的异源双链体双链dna，从而形成具有5'或3'突出端的粘端块；以及

22、重复加热步骤和退火步骤多次，以形成共价闭合环状dna和钝端线性dna序列的混合物。

23、任选地，可以在单独的反应中产生seb，然后组合产生更大的seb或共价闭合环状dna (cccdna)。例如，如果要接合20个dna前体，则可以在反应1中接合五个，在反应2中五个，在反应3中五个，在反应4中五个。然后，通过进一步的htla或chtla反应，或者通过将这四个反应各自的产物的经设计的互补粘端直接酶连接，例如，在适当的温度下使用t4 dna连接酶或任何其它合适的dna连接酶，可以将这四个反应的产物组合并接合。

24、在另一个方面，可以从前体dna中纯化反应1至反应4的所期望的seb产物，例如，通过琼脂糖凝胶纯化或任何其它分离手段，然后组合进行htla或chtla反应，以产生seb或seb和包含所有20个前体dna的钝端产物。

25、根据本发明的前体dna的长度可以在约20个核苷酸至数千个核苷酸的范围内，更优选地，对于双链前体为约200个至10000个核苷酸且对于单链前体为30个至200个核苷酸。dna前体片段的数量将决定所形成的seb的大小和长度以及通过本发明方法制备的seb末端上的粘端的长度。

26、因此，本发明提供了需要温度循环的核酸连接方案，诸如从例如约95℃循环至约60℃的较低温度，持续一个、两个、三个或更多个循环。

27、在又另一个方面，本发明提供了一种形成具有5'或3'突出端的粘端块(seb)的方法，所述方法包括：

28、提供至少三个单链前体dna分子(寡核苷酸)，经设计使其正确地组装，以产生所定义的dna序列；

29、将所述至少三个配对前体dna引入缓冲介质中；

30、在熔融温度下施加热，致使所述至少三个配对前体dna片段熔融；以及

31、在存在热稳定性连接酶的情况下降低熔融温度以退火，从而产生了通过使具有单链末端的互补区域进行碱基配对而形成的异源双链体双链dna，从而形成具有5'或3'突出端的粘端块。

32、根据本发明的前体dna片段包含指明dna长度在约0.1 kb至约100 kb的范围内，更优选在约0.5 kb至约5 kb的范围内的计量单位。互补配对前体dna片段的数量决定了通过本发明方法制备的seb的大小和长度。

33、本发明的其它特征和优点将从下面的详细描述、附图和权利要求中显而易见。