一种兼具pH敏感与潜在结肠靶向的蛋白偶联物的制备方法

本发明涉及一种兼具ph敏感与潜在结肠靶向的蛋白偶联物的制备方法，属于功能性食品复合纳米颗粒制备。

背景技术：

1、作为植物来源的膳食酚类化合物，紫檀芪具有较高的体内安全性，其苯环中的两个甲氧基会使化合物具有更高的亲脂性和代谢稳定性，同时其生物利用率是白藜芦醇的4倍，具有更好的细胞膜渗透性和药代动力学特征等药理活性，可作为靶向治疗的功能因子，通过调节肠道菌群，保护结肠组织免受氧化损伤，缓解肠道炎症等慢性疾病，在食品及医药领域具有广阔的应用前景。然而它具有水溶性极低，在光，热和其他环境因素的存在下降解或氧化等缺陷，对其生物活性造成极大的负面影响，从而限制了其开发和应用。

2、植物来源的膳食酚类化合物经常被用作改善蛋白质营养成分和感官特性的功能性成分。通过多酚的共价接枝可以赋予蛋白质新的功能性质，这对于构建高理化稳定性的靶向传递体系至关重要。单宁酸(单宁酸)具有大量酚羟基结构，因此具有很强的供氢能力，能够有效地清除氧自由基，其邻苯三酚结构中的邻位酚羟基很容易被氧化成醌类结构，在有酶、充足的水分以及较高ph值(如ph>3.5)时，氧化反应进行得更快，从而消耗环境中的氧。

3、此外，单宁酸还具有多种良好的生理功能，如收敛、抗菌和抗氧化特性。甜菜碱与漆酶联合交联单宁酸和乳清分离蛋白之间的共价作用不仅可以降低乳清分离蛋白纳米颗粒的表面疏水性，而且可以提高其稳定性和对疏水活性物质的包封及负载效率。

4、目前，诸多研究使用单宁酸改性乳清分离蛋白。专利cn110547442a公开了将乳清蛋白和单宁酸制备纳米颗粒，并将其做为pickering乳液稳定剂，具有较好的氧化稳定性。专利cn115363201b公开了使用乳清蛋白和单宁酸制备改善血糖的液态食品；文献“乳清分离蛋白与单宁酸相互作用提高稻米油pickering乳液的稳定性”公开了使用乳清蛋白-单宁酸纳米颗粒改善稻米油pickering乳液的热稳定性、盐离子稳定性以及氧化稳定性。上述技术只注重于纳米颗粒在后续乳液体系中的应用，忽略了单宁酸改性乳清蛋白自身的性质及其作为包埋载体的可能性。

5、因此，开发乳清分离蛋白-单宁酸偶联纳米颗粒自身的性质，并进一步降低其表面疏水性并提高在包封和运载药物在肠道期间的稳定性，在扩大其肠道靶向递送疏水性生物活性物质方面具有重要的意义。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供一种兼具ph敏感与潜在结肠靶向的蛋白偶联物的制备方法，采用酶诱导和反溶剂沉淀法制备偶联物。本发明制备的乳清分离蛋白-单宁酸蛋白偶联物接枝度极高，抗氧化性显著提升，对紫檀芪的包封稳定性高，在胃肠道的极端ph环境下稳定性良好，兼具ph敏感与肠道靶向的双重特性。

2、本发明中wt％指的是质量分数。

3、本发明的第一个目的是提供一种制备兼具ph敏感与潜在结肠靶向的蛋白偶联物的方法，所述方法包括：

4、(1)将乳清分离蛋白水溶液和甜菜碱水溶液混合，得到混合溶液；将混合溶液和单宁酸水溶液混合，得到反应液；

5、(2)反应液中加入漆酶，孵育、透析，得到透析后的反应液；干燥得到兼具ph敏感与潜在结肠靶向的蛋白偶联物。

6、在一种实施方式中，步骤(1)中乳清分离蛋白水溶液的浓度为0.5～5wt％，甜菜碱水溶液的浓度为0.1～3wt％，单宁酸水溶液的浓度为0.1～1wt％。

7、优选地，乳清分离蛋白水溶液的浓度为0.5～3wt％，甜菜碱水溶液的浓度为0.1～2wt％，单宁酸水溶液的浓度为0.2～0.8wt％。

8、在一种实施方式中，步骤(1)中乳清分离蛋白水溶液和甜菜碱水溶液按照体积比1：0.1～1混合；混合溶液和单宁酸水溶液按照体积比1：0.1～1混合。

9、优选地，乳清分离蛋白水溶液和甜菜碱水溶液按照体积比1：0.5～1混合；混合溶液和单宁酸水溶液按照体积比1：0.5～1混合。

10、在一种实施方式中，步骤(2)中漆酶的添加量为30～120u/g乳清分离蛋白。

11、优选地，漆酶的添加量为50～70u/g乳清分离蛋白。

12、在一种实施方式中，步骤(2)中孵育是30～50℃孵育8～16h。

13、在一种实施方式中，步骤(2)的透析是使用截留分子量为8000～14000da的透析袋，透析液为纯水溶液，透析时间为12～24h。

14、在一种实施方式中，步骤(1)中混合是200～900rpm搅拌0.5～3h；

15、在一种实施方式中，步骤(2)中混合是200～900rpm搅拌5～8h。

16、本发明的第二个目的是提供任一上述方法制备得到的兼具ph敏感与潜在结肠靶向的蛋白偶联物。

17、本发明的第三个目的是提供一种包埋活性物质的载体，由上述的兼具ph敏感与潜在结肠靶向的蛋白偶联物和活性物质制备得到；

18、制备方法包括步骤：

19、兼具ph敏感与潜在结肠靶向的蛋白偶联物和水配制得到反应液，将活性物质和反应液混合、干燥，制备得到包埋活性物质的载体。

20、在一种实施方式中，所述活性物质包括但不限于紫檀芪、姜黄素、白藜芦醇、茶多酚、槲皮素、番茄红素、虾青素。

21、在一种实施方式中，干燥包括但不限于蒸发干燥、冷冻干燥。

22、本发明的第四个目的是提供一种包埋紫檀芪的方法，将上述的兼具ph敏感与潜在结肠靶向的蛋白偶联物和水配制得到反应液，紫檀芪和无水乙醇配制得到紫檀芪无水乙醇溶液；将紫檀芪无水乙醇溶液加入反应液，混合、干燥，得到紫檀芪包埋载体。

23、在一种实施方式中，紫檀芪和兼具ph敏感与潜在结肠靶向的蛋白偶联物的质量比为1：10～1：5。

24、在一种实施方式中，紫檀芪和无水乙醇配制得到紫檀芪无水乙醇溶液(紫檀芪浓度为5～15mg/ml)，兼具ph敏感与潜在结肠靶向的蛋白偶联物和水配制得到兼具ph敏感与潜在结肠靶向的蛋白偶联物(紫檀芪浓度为80～120mg/ml)，即反应液；其中，紫檀芪和蛋白偶联物的质量比5～10：1，将紫檀芪无水乙醇溶液滴加至反应液中，200～700rpm搅拌1～5h、干燥得到紫檀芪包埋载体。

25、本发明的第五个目的是提供上述的兼具ph敏感与潜在结肠靶向的蛋白偶联物或上述的包埋活性物质的载体在制备食品、药品或保健品中的应用；

26、所述食品包括：抗氧化剂、添加剂、乳化剂、稳定剂、活性物质包埋/递送载体、风味物质包埋/递送载体或功能性食品包埋/递送载体；所述药品包括：难溶性药物包埋/递送载体、蛋白质包埋/递送载体、维生素包埋/递送载体、抗生素包埋/递送载体。

27、本发明的有益效果

28、为解决上述问题，本发明提供一种兼具ph敏感与潜在结肠靶向的蛋白偶联物的制备方法，采用酶诱导和反溶剂沉淀法制备偶联物。本发明制备的蛋白偶联物(即乳清分离蛋白-单宁酸蛋白偶联物)接枝度极高，抗氧化性显著提升，对紫檀芪的包封稳定性高，在胃肠道的极端ph环境下稳定性良好，兼具ph敏感与肠道靶向的双重特性。

29、具体地，

30、(1)本发明使用的乳清分离蛋白属于天然生物聚合物，价格低廉，绿色环保。

31、(2)本发明使用的单宁酸属于多羟基黄酮醇类化合物，可以与乳清分离蛋白发生强烈的共价反应，改善其稳定性。

32、(3)本发明以具有抗氧化和抗炎活性的紫檀芪作为疏水性生物活性物质，以漆酶快速诱导的乳清分离蛋白-单宁酸偶联物作为载体，采用了反溶剂沉淀法制备负载紫檀芪的乳清分离蛋白-单宁酸蛋白偶联物，材料低廉环保，方法简单易操作，同时还为负载抗氧化和肠道靶向的活性物质提供了理论基础。

33、(4)本发明制备的兼具ph敏感与潜在结肠靶向的蛋白偶联物粒径为97.28nm、多分散指数pdi仅0.26；对单宁酸的结合当量达到143.01mg/g，接枝效率为74.4％；具有良好的抗氧化稳定性，dpph自由基清除率达到99.25％、abts+自由基清除率达到93.20％；

34、(5)本发明制备的兼具ph敏感与潜在结肠靶向的蛋白偶联物对紫檀芪的包封及在胃肠道的缓慢释放有正向影响，在480min(从口腔到小肠消化时间通常为2到6小时)时紫檀芪在结肠部位仍有43.60％的保存率，具备有效提升递送至结肠部位的巨大潜力。