一种用于治疗口腔黏膜下纤维性变的水凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明属于口腔黏膜病治疗材料，涉及一种用于治疗口腔黏膜下纤维性变的水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、口腔黏膜下纤维性变(oral submucous fibrosis,osf)是一种以上皮萎缩、结缔组织内广泛胶原纤维沉积和肌成纤维增加为特征的慢性隐匿性进行性口腔黏膜疾病，为口腔鳞状细胞癌主要的癌前状态之一。全球osf患者约为500万，该病好发于印度及东南亚国家和地区，以及中国南部，而在欧洲、美国及日本等地区发病率较低。这与osf的相关危险因素如嚼槟榔、吸烟、饮酒和食用辛辣食物等密切相关。osf恶性转化率较高，约为7％～15％，因此，在处于癌变早期的osf阶段阻断或延缓疾病进展尤为必要。在临床分期中，osf早期表现为血管充血和炎症；中期血管减少并出现纤维性变，口腔黏膜发白；晚期血管闭塞，口腔黏膜出现纤维条带，患者开口明显受限。其组织病理基础为口腔黏膜上皮细胞和上皮钉突的形态改变及上皮下致密胶原条索沉积。这些临床表现及病理基础可作为osf的诊断依据之一。由于其发病机制复杂，治疗棘手，大多数病例选择保守治疗。

2、osf的治疗难点如下：一、手术创伤大，费用高，易形成瘢痕组织。口腔黏膜下纤维性变一旦进入晚期，将波及口腔颌面部大面积组织，颊黏膜组织僵硬，面部变形，有肿物突起，张口困难，甚至影响呼吸和吞咽。为切除病变组织，常须切掉口腔大部分软组织，甚至包括舌组织。osf患者容貌受到影响，通常不愿出门社交，易产生自卑轻生心理。此外，由于口腔颌面大部分组织被切除，进食和言语功能受到影响，给患者的生活带来了诸多不便。该类手术疗程复杂，手术复健及疗养费用开销不菲，给患者本人及家庭带来了沉重的经济和心理负担，亦是严峻的社会公共卫生问题。二、药物治疗效果不理想，副作用多，易复发。口腔黏膜下纤维性变尚无明确的推荐使用药物和治疗方案标准，西药中使用较多的糖皮质激素如中效糖皮质激素曲安奈德和长效糖皮质激素倍他米松在短期内均能取得较好效果，但副作用十分明显，且常需与中药联合使用。光动力疗法操作简便，见效快，但价格昂贵，且易复发，一般不推荐使用。中药价格低廉，副作用少，但目前常用的天然药物如姜黄素、丹参、芦荟等治疗效果欠佳。故需寻找新兴的有潜能的强抗纤维化治疗药物，作为临床治疗的备选方案。三、osf给药剂型单一，给药效率低，作用时间短。osf治疗常用剂型为口服和注射用药，药物利用效率不高。口服会因肝脏首过效应使生物利用度降低，从而降低药效。局部涂抹因药物在口腔内停留时间短，难以长时间作用。注射治疗虽可直接触之病灶，但带来的疼痛感极大降低了患者的临床依从性。水凝胶是一种新兴的优势载药材料，能适应口腔复杂的环境，广泛应用于各类口腔疾病的治疗中，但在osf治疗中的相关报道和应用很少，缺少相关的实验数据和临床转化应用。

3、目前已有相关的研究，例如中国专利申请号cn202010345200.6用于口腔黏膜下纤维性变的敷料及其制备和应用，该发明属于外用口腔癌治疗材料技术领域，具体涉及缓解口腔癌前期病变之一口腔黏膜下纤维性变水凝胶医用敷料，为化学交联铯离子的海藻酸盐/丙烯酸/蒙脱石复合水凝胶。此外，该发明还提供了所述的水凝胶的制备方法和应用。该发明所述的复合水凝胶，创新地在海藻酸盐/丙烯酸/蒙脱石复合水凝胶中加入铯离子，调控其对槟榔碱伤害后的细胞保护作用，可以降低口腔上皮细胞炎症反应，增加口腔粘膜黏连蛋白分泌从而构筑上皮屏障，调控胶原紊乱状态，阻止槟榔碱进一步伤害，阻止槟榔碱进一步伤害，从而阻止osf恶化为口腔癌，达到预防目的。

4、又例如中国专利申请号cn201310042448.5一种含有丹参和三七有效成分的多组分同步均衡释药长效制剂，该发明公开了一种含有丹参和三七有效成分的多组分同步均衡释药长效制剂，属于中药领域及药物制剂领域。该制剂是由丹参总酚酸速释单元、丹参总酚酸中效缓释单元、丹参总酚酸长效缓释单元，总丹参酮速释单元、总丹参酮肠溶单元、总丹参酮长效缓释单元，三七总皂苷速释单元、三七总皂苷肠溶单元、三七总皂苷长效缓释单元等九个部分。该药物可用于治疗心脑血管疾病，药物可持续释药12个小时。

5、目前现有技术尚存在一些不足：一、治疗手段缺陷：osf目前的治疗手段主要分为手术治疗、药物治疗和物理治疗，多为保守治疗。手术治疗包括切除纤维带、皮片移植等，这些只能对患者的张口困难症状起到一定的改善作用，容易复发，且因为瘢痕挛缩等风险难以被患者所接受。故药物治疗常为首选方案。药物治疗分西药治疗和中药治疗。在国内，丹参联合糖皮质激素广泛应用于osf临床治疗，但糖皮质激素无法逆转纤维组织异常沉积和恢复口腔黏膜弹性，过度或不适当地应用会产生不良反应及糖皮质激素抵抗，且有高复发性和强副作用。而单纯丹参注射往往只能改变osf患者的张口受限程度，但对患者的黏膜灼痛症状缓解效果欠佳。二、治疗方式不足：手术创伤大，费用高，一定程度上造成患者容貌损毁，影响患者社交及心理健康。传统的给药方式中，注射治疗会引起疼痛，患者依从性不高，且只能由医务人员操作，患者无法在家自行上药。口服给药因为肝脏首过效应，药物利用率降低。含服给药比口服给药的利用率高，但药物溶于唾液中，可能会造成药物成分的损耗，能够持续作用于口腔黏膜局部的药物少。雾化给药能够充分扩散到黏膜表面，但作用时间短。

技术实现思路

1、针对现有技术中口腔黏膜下纤维性变的治疗疗效欠佳、副作用大、操作繁琐、价格高昂的不足，本发明提供了一种用于治疗口腔黏膜下纤维性变的水凝胶及其制备方法和应用，本发明的目的在于为osf的临床治疗提供一种新的药物选择，并改进给药剂型，使其能够高效持续作用于病灶，减轻患者治疗过程中的不适感和经济负担。有望成为一种广泛用于临床治疗用药的优选方案。

2、本发明技术方案如下：

3、取丹参酮ⅱa(tanⅱa)0.2g溶解于无水乙醇20ml中，均匀分散预胶化淀粉2g，水浴加热挥发溶剂，制成tanⅱa改性粒子，以增加药物颗粒的水溶性。取三七总皂苷(pns)1g，溶于超纯水后均匀混合，所得溶液冷冻干燥，研磨过80目筛，制成pns-tanⅱa复合粒子；

4、然后以四臂聚乙二醇降冰片烯(4-arm peg-a-nb)为水凝胶基本网络框架，结合基质金属蛋白酶9(mmp-9)特异多肽为连接网络桥梁，对osf患者口腔内异常升高的mmp-9智能响应，同时引入光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)促进二者连接，以上反应均使用pbs溶液为溶剂进行以完成水凝胶前驱液制备；

5、随后将pns-tanⅱa复合粒子与水凝胶前驱液(1mg：100μl)均匀混合即完成水凝胶药物负载，使用365nm紫外灯于约1cm处照射载药水凝胶前驱液30s后即完成载药水凝胶制备。

6、以下是本发明的技术原理：

7、1.丹参酮ⅱa改性原理：

8、利用溶剂沉积法使亲脂性丹参酮ⅱa改性为亲水性。将药物组装成固体分散体(固体分散体是由至少两种不同的组分，即亲水性基质和亲脂性药物组成的一组固体产物，药物可被分散成无定形颗粒或结晶颗粒形态)，进而改善水溶性差的药物在药物组合物中的溶解度，并加快溶解速度，提高药物的生物利用度。

9、2.水凝胶光固化原理：

10、水凝胶光固化是一种利用紫外线(uv)照射水凝胶前驱液(预聚体)，使其快速凝固成固态的过程。光引发剂是一类能吸收特定波长的光线并转化为化学活性物质的化合物。在水凝胶材料中加入适量的光引发剂后，当该材料受到紫外线照射时，光引发剂会吸收光能并转化为能使水凝胶发生化学反应的活性物质。这些活性物质引发链式反应，从而将水凝胶中的单体分子进行交联，形成三维的网络结构，从而使水凝胶固化。本凝胶使用的光引发剂lap是一种水溶性、细胞相容的i型光引发剂，常用于水凝胶或其它聚合物材料的聚合，其在365nm紫外光下具有较快聚合速率，故选择365nm紫外灯照射水凝胶前驱液。

11、3.水凝胶mmp-9(基质金属蛋白酶9)特异多肽工作原理：

12、在正常组织中，mmp-9表达较少或不表达，药物不释放。在病理组织中，即osf的组织中，mmp-9表达较高，水凝胶中的mmp-9特异多肽控制药物释放，用于治疗osf。

13、基质金属蛋白酶(mmps)是一类主要降解胶原纤维的内肽酶家族，广泛表达于多种细胞。在生理条件下，mmps的活性和表达受特异性抑制剂、细胞因子、激素以及细胞-细胞相互作用的严格调控。然而，在病理条件下，如炎症、纤维化疾病等，mmps的调节功能失常，导致其活性高度上调。mmp-9属明胶酶，可水解变性胶原及基膜主要成分iv型胶原，在多种病理过程中发挥关键作用。mmp-9在正常颊黏膜中大多呈阴性表达，而osf早期mmp-9表达上调，说明mmp-9的高表达可证实osf的早期发病。

14、水凝胶mmp-9特异多肽(纯度>95％，购自杭州专肽生物技术有限公司)能对mmp-9特异性响应，其设计基于mmps位点特异性分析，通过在p1’中放置亮氨酸，在p3’中放置甘氨酸，在p3中放置脯氨酸，设计为mmp-9切割优化的双半胱氨酸肽连接子，优化了在水合环境中交联效率不足、mmp-9敏感性和特异性低的性能。

15、

16、定制的mmp-9敏感肽连接子(cgpgg↓laggc)

17、4.水凝胶网络交联原理：

18、以4臂peg-a-nb为mmp-9水凝胶支架，通过mmp-9特异多肽上巯基与4臂peg-a-nb聚合物中降冰片烯光聚合，将多肽与支链的4臂peg交联，形成水凝胶网络，该硫醇-降冰片烯阶梯生长光聚交联度几乎完全。

19、本发明的目的通过以下技术方案实现：

20、一种用于治疗口腔黏膜下纤维性变的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

21、s1三七总皂苷-丹参酮ⅱa水溶液的制备：

22、s1.1溶剂沉积法使丹参酮ⅱa改性：

23、s1.1.1将0.2g丹参酮ⅱa粉末溶于20ml无水乙醇中；

24、s1.1.2向溶液中分散2g预胶化淀粉(pgs)，在40-50℃水浴加热下恒速搅拌至溶液完全挥发；

25、s1.1.3将产品置于恒温干燥箱中干燥至恒重；

26、s1.1.4研磨物料至能全部通过80目筛，得到丹参酮ⅱa改性粒子；

27、s1.1.5覆锡纸封口膜置于冰箱中备用，避光保存；

28、s1.2配置冻干前驱液：

29、用超纯水将1g三七总皂苷和上述丹参酮ⅱa改性粒子溶于小烧杯中制成冻干前驱液；

30、s2冷冻干燥样品的预处理(冷冻阶段)：

31、s2.1将冻干前驱液倒入托盘，溶液高度约1mm；

32、s2.2使用封口膜封住托盘口；

33、s2.3将盛有冻干前驱液的托盘放入超低温冰箱冻存，-80℃，4h～12h；

34、s3冷冻干燥机的使用(升华干燥阶段)：

35、s3.1打开干燥腔电源，等待20-30min至温度指示达到-40℃开始操作；

36、s3.2从超低温冰箱中取出s2得到的样品，使用尖锐物品在封口膜上扎小孔；

37、s3.3将其放入干燥腔，关闭干燥室连通大气的阀门，保证气密性良好；

38、s3.4首先检查真空泵油位高低，确认正常后连接电源(如油位不正常则需调整真空泵气压)，然后开启干燥腔背后阀门，使其与真空泵连通，最后启动真空泵，等待20-30min，观察样品变化，确认无暴沸现象后，继续在干燥室内充分干燥12h；

39、s4脱水及干燥后样品的存取(脱水阶段)：

40、s4.1关闭干燥腔背后与真空泵相连阀门，关闭真空泵，拔下真空泵电源；

41、s4.2旋松气阀，使干燥腔内气压恢复至与大气相同；

42、s4.3关闭冷冻室电源，拔下电源插座，取下有机玻璃罩；

43、s4.4拿出干燥样品后，迅速覆上一层封口膜并用细线扎紧(防止样品吸潮)；

44、s4.5清理整理仪器；

45、s5配制含光引发剂lap的pbs溶液：

46、s5.1在电子秤上放置15ml烧杯、将15ml离心管放置在烧杯内，调零电子秤；

47、s5.2使用100-1000μl移液枪吸取10mlpbs磷酸盐缓冲液于15ml离心管中，pbs磷酸盐缓冲液密度为1g/ml，电子秤读数为10g；

48、s5.3计算配制10ml浓度0.05wt％(w/w，即溶质质量/溶液质量)lap的pbs磷酸盐缓冲液所需lap为5mg(lap质量与pbs质量相差大于两个数量级，lap质量忽略不计)；

49、s5.4使用分析天平称量5mg lap后将其加入装有pbs磷酸盐缓冲液的15ml离心管，将振荡器调至自动模式(b模式)，转速设置为800rpm，将15ml离心管放置在振荡器上振荡混匀5分钟，得到10ml浓度0.05wt％lap的pbs磷酸盐缓冲液，用锡箔纸包住离心管，放入含冰袋的泡沫纸盒中备用(避免光引发剂因外界光和温度影响而失活)；

50、s6配制含peg聚合物的pbs溶液、含mmp-9特异多肽的pbs溶液：

51、s6.1使用分析天平称量50mg的4-arm-peg-nb聚合物粉末、7.93mg定制的mmp-9特异多肽粉末，分别置于1.5ml半圆柱底ep管中(保持前驱液中4臂peg-a-nb聚合物浓度为10wt wt％，且保持4臂peg-a-nb聚合物上烯键与mmp-9特异多肽上硫醇的比例为1:1)；

52、s6.2使用100-1000μl和10-100μl移液枪吸取342μl步骤一中配好的浓度0.05wt％lap的pbs磷酸盐缓冲液加入装有4臂peg-a-nb聚合物粉末的ep管中混匀；

53、s6.3使用100-1000μl移液枪吸取100μl步骤一中配好的浓度0.05wt％lap的pbs磷酸盐缓冲液加入装有定制mmp-9特异多肽粉末的ep管中混匀；

54、s6.4将振荡器调至自动模式(b模式)，转速设置为800rpm，分别将2管溶液放置在振荡上振荡混匀5分钟，得到含4臂peg-a-nb聚合物的pbs溶液和含有mmp-9特异多肽的pbs溶液；

55、s7配制mmp-9酶响应水凝胶前驱液：

56、s7.1使用100-1000μl移液枪吸取步骤二中配好的含4臂peg-a-nb聚合物的pbs溶液于装有mmp-9特异多肽的pbs溶液的半圆柱底ep管中，混匀；

57、s7.2将振荡器调至自动模式(b模式)，转速设置为800rpm，将ep管放置在振荡器上振荡混匀5分钟，得到442μlmmp-9酶响应水凝胶前驱液；

58、s8配制载药水凝胶前驱液：

59、s8.1将pns-tanⅱa溶于凝胶前驱液，且保证pns-tanⅱa:凝胶前驱液为1mg:100μl；

60、s9紫外灯光固化mmp-9酶响应水凝胶前驱液、保存：

61、s9.1使用波长为365nm紫外灯在距离为1cm处照射mmp-9酶响应水凝胶前驱液30s，光固化为mmp-9酶响应载药水凝胶；

62、s9.2将固化后的mmp-9酶响应载药水凝胶放置于干燥器皿内低温存储。

63、进一步的，s2.2使用封口膜封住托盘口，目的是使冷冻充分，防止样品水溶液在干燥腔真空环境中暴沸，并避免不同样品间的污染。

64、进一步的，s3.2中使用尖锐物品在封口膜上扎小孔，目的是便于升华的水蒸气从样品体系脱离。

65、进一步的，s3.3保证气密性良好，目的是准备营造真空环境。

66、进一步的，s3.4确认无暴沸现象后，目的是反映样品冷冻完全，暴沸则说明样品冷冻不完全。

67、进一步的，s4.2中，起初旋松阀门时需缓慢小心，以听不到“嘶嘶”气流声为宜，防止过强气流进入而吹飞样品。

68、进一步的，s5.4中使用锡箔纸包住离心管，放入含冰袋的泡沫纸盒中备用，目的是避免光引发剂因外界光和温度影响而失活。

69、进一步的，s6.1中使用分析天平称量50mg的4臂peg-a-nb聚合物粉末、7.93mg定制的mmp-9特异多肽粉末，目的是保持前驱液中4臂peg-a-nb聚合物浓度为10wt％，且保持4臂peg-a-nb聚合物上烯键与mmp-9特异多肽上硫醇的比例为1:1。

70、一种用于治疗口腔黏膜下纤维性变的水凝胶，采用上述一种用于治疗口腔黏膜下纤维性变的水凝胶的制备方法得到，该水凝胶具有如下技术指标：

71、水凝胶性能表征：①水凝胶外观：无色透明，呈晶冻状，为经典凝胶形态；

72、②水凝胶红外光谱表征：水凝胶与四臂peg-a-nb相比，烯烃c-h面外弯曲振动(1000-675cm-1)和面内弯曲振动(1430-1290cm-1)明显减弱，c＝c特征伸缩(1680-1640cm-1)消失，通过双键反应形成凝胶网络，凝胶交联成功；

73、③水凝胶扫描电镜表征：水凝胶具有多孔和相互连通的微观结构，形态类似再生细胞外基质；

74、④流变性能：水凝胶具有稳定的网络结构、较强的弹性和一定的粘性；

75、⑤体外溶胀性能：水凝胶的平衡溶胀率为300％，适应口腔高度湿润的环境。

76、本发明还涉及上述一种用于治疗口腔黏膜下纤维性变的水凝胶的应用，用于制备治疗口腔黏膜下纤维性变的药物组合物。

77、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

78、1、本发明所述的一种用于治疗口腔黏膜下纤维性变的水凝胶，具有稳定的网络结构、较强的弹性和一定的粘性。溶胀性能高，能够满足在口腔润湿动态的环境中长时间作用不变形脱落的要求。本发明所述的水凝胶医用敷料，成分安全无毒，具有良好的应用前景。

79、2、本发明所述的一种用于治疗口腔黏膜下纤维性变的水凝胶的制备方法，创新地预先用mmp-9特异多肽作为药物释放的靶点，利用硫醇-降冰片烯的光聚合反应将多肽与支链的4臂peg交联，形成水凝胶网络。并将淀粉改性后的复合粒子修饰至凝胶中，成功制得负载pns-tanⅱa复合粒子的特异酶响应水凝胶敷料。mmp-9切割优化的双半胱氨酸多肽，优化了在水合环境中交联效率不足、mmp-9敏感性和特异性低的性能。还能够调控pns-tanⅱa的释放，提高水凝胶治疗osf的效果。

80、3、本发明所述的一种用于治疗口腔黏膜下纤维性变的水凝胶的应用，该制备方法制得的水凝胶具有促进口腔黏膜修复的潜能。本发明中，直接在osf的病灶部位贴敷本发明所述的水凝胶，通过所述的水凝胶中的各成分的联合作用，创新地提供了一种中药复合粒子治疗osf从而预防口腔癌的水凝胶。