以一碳化合物为原料合成L-丙氨酸的工程菌株及应用的制作方法

本发明属于工程菌，具体涉及以一碳化合物为原料合成l-丙氨酸的工程菌株及应用。

背景技术：

1、l-丙氨酸是一种重要的化工原料，广泛应用于日化、医药及保健品、食品添加剂、饲料等行业。更重要的是，l-丙氨酸可以作为单体合成新型绿色螯合剂甲基甘氨酸二乙酸(methyl glycine diacetic acid，以下简称mgda)。mgda由巴斯夫在2010年发现，兼具自然生物降解、螯合能力强、毒理安全、洗涤残留少等多重优点，是一种优质的新型环保螯合剂，可添加于各种类型洗涤剂产品中。2019年，mgda的需求量约16万吨，根据中国生物发酵产业协会预测，未来全球mgda市场将以约22％的年复合增长率持续扩大，到2023年全球mgda的需求量将达到39.34万吨。除用于合成mgda外，l-丙氨酸还可用于合成氨基酸表面活性剂，维生素b6、丙谷二肽等保健品，具有特殊的甜味和鲜味的食品添加剂，促进动物生长的饲料添加剂等。

2、据中国生物发酵产业协会数据，2016-2019年丙氨酸全球需求量年复合增长率约为14％，至2019年全球需求量约5万吨(其中l-丙氨酸需求量约为3.8-4.2万吨)；预计未来市场仍将会以约12％的年复合增长率快速增长，到2023年全球市场需求预计可达8.1万吨。其中，日化领域作为l-丙氨酸占比最大的下游应用(2019年占比约为55％)增速最为明显，而其他领域如医药、食品添加剂和饲料领域需求则较为平稳。

3、l-丙氨酸规模化生产经历了化工合成、酶法、发酵法的技术迭代，目前发酵法占据了工业化主流(2019年占比以超过90％)，生产成本持续下降，下游应用场景持续拓宽。目前华恒生物的发酵法技术处于行业领先地位，以葡萄糖为原料，通过厌氧发酵生产l-丙氨酸，发酵周期≤40小时，发酵过程无需通入空气，无co2排放，转化率在95％以上，相关机构预测其新建项目的生产成本在7,000元/吨以下。l-丙氨酸厌氧发酵以葡萄糖作为碳源，而葡萄糖主要通过淀粉水解制取，因此以葡萄糖为原料合成l-丙氨酸的成本受粮食价格的影响波动较大，且面临与人争粮等系列问题。

4、甲醇和甲醛都是价格低廉、易于获得的有机一碳原料，其能量密度高于葡萄糖等原料，还可为生物合成提供更多还原力，从而提高生物制造的转化率，是生物制造的理想原料之一。甲醇的制备主要是合成法。目前工业上主要是采用一氧化碳加压催化氢化法合成甲醇，其中原料气一氧化碳可以来自煤、石油、天然气等加工产品。另一方面，利用二氧化碳加氢耦合水电解制甲醇是一种潜在、高效的甲醇合成途径。二氧化碳作为一种廉价易得、环境友好的可再生碳一资源，其资源化利用不仅可减少二氧化碳排放，而且可提供绿色制备的技术路线，对绿色与可持续发展意义重大。建立以二氧化碳、甲醇、甲醛等为原料合成l-丙氨酸的路线，具有极大的经济价值和社会价值。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种以一碳化合物为原料合成l-丙氨酸的工程菌株。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种重组菌，所述重组菌能以甲醇为原料合成l-丙氨酸。

4、上述重组菌中存在以下代谢反应：

5、(a1)将甲醇转化为甲醛；

6、(a2)由甲醛和d-木酮糖-5-磷酸合成二羟基丙酮和3-磷酸甘油醛；

7、(a3)将二羟基丙酮转化为磷酸二羟基丙酮；

8、(a4)磷酸二羟基丙酮转化为3-磷酸甘油醛

9、(a5)将3-磷酸甘油醛转化为l-丙氨酸。

10、上述重组菌中还存在如下代谢反应：

11、(a6)将3-磷酸甘油醛转化为d-木酮糖-5-磷酸。

12、上述重组菌中：

13、所述(a1)由醇氧化酶(alcohol oxidase，aox)催化，

14、所述(a2)由二羟基丙酮合成酶(dihydroxyacetone synthase，das)催化；

15、所述(a3)由二羟基丙酮激酶(dihydroxyacetone kinase，dak)催化；

16、所述(a4)由果糖磷酸丙糖异构酶(triose-phosphate isomerase，tpi)催化；

17、所述(a5)由3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)、磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase)、磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase)、烯醇化酶(enolase)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase)、丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase，alad)催化；

18、所述(a6)由果糖二磷酸醛缩酶(fructose-bisphosphate aldolase，fba)、果糖-1,6-二磷酸酶(fructos e-1,6-bisphosphatase，fbp)、转酮酶(transketolase，tkt)、转醛酶(transaldolase，tal)、核糖-5-磷酸异构酶(ribose 5-phosphate isomerase，rpi)和磷酸核酮糖差向异构酶(ribulose-phosphate 3-epimerase，rpe)催化。

19、所述(a1)、(a2)、(a3)和(a4)是为了在上述重组菌中构建或强化甲醇或甲醛同化途径。

20、所述(a5)是为了在在上述重组菌中构建l-丙氨酸合成路径。

21、所述(a6)是为了在重组菌中构建或增强由3-磷酸甘油醛转化为d-木酮糖-5-磷酸的途径，即构建或增强上述重组菌中五碳化合物回补途径。

22、上述重组菌中不存在由以下至少一种酶催化的代谢反应：d-乳酸脱氢酶(d-lactate dehydrogenase，ld h)、乙酰辅酶a水解酶(acetyl-coa hydrolase，ach)、乙酰辅酶a合成酶(acetyl-coa synthetase，acs)和丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，pdc)。

23、上述重组菌具有下述b1)-b5)的特征：

24、b1)含有丙氨酸脱氢酶(alad)基因或/和含有调控丙氨酸脱氢酶(alad)基因表达的物质或/和含有调控丙氨酸脱氢酶(alad)活性或含量的物质；

25、b2)含有醇氧化酶(aox)基因或/和含有调控醇氧化酶(aox)基因表达的物质或/和含有调控醇氧化酶(aox)活性或含量的物质；

26、b3)含有二羟基丙酮合成酶(das)基因或/和含有调控二羟基丙酮合成酶(das)基因表达的物质或/和含有调控二羟基丙酮合成酶(das)活性或含量的物质；

27、b4)含有二羟基丙酮激酶(dak)基因或/和含有调控二羟基丙酮激酶(dak)基因表达的物质或/和含有调控二羟基丙酮激酶(dak)活性或含量的物质；

28、b5)含有果糖磷酸丙糖异构酶(tpi)基因或/和含有调控果糖磷酸丙糖异构酶(tpi)基因表达的物质或/和含有调控果糖磷酸丙糖异构酶(tpi)活性或含量的物质。

29、上述调控可为上调或增强或提高前述蛋白质的编码基因表达或所述蛋白质含量或活性，所述调控也可为下调或抑制或降低前述蛋白质的编码基因表达或所述蛋白质含量或活性。

30、在本发明的一些具体实施例中，所述调控丙氨酸脱氢酶(alad)基因、醇氧化酶(aox)基因、二羟基丙酮合成酶(das)表达、二羟基丙酮激酶(dak)基因和果糖磷酸丙糖异构酶(tpi)表达可为上调或增强或提高前述基因表达。更为具体的是，通过增加拷贝数的方式加强前述基因在受体菌中的表达。

31、上述受体菌为巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)，更为具体的是，前述巴斯德毕赤酵母(pichia past oris)为gs115菌株。

32、上述述重组菌具有下述b6)-b11)的特征：

33、b6)含有果糖二磷酸醛缩酶(fba)基因或/和含有调控果糖二磷酸醛缩酶(fba)基因表达的物质或/和含有调控果糖二磷酸醛缩酶(fba)活性或含量的物质；

34、b7)含有果糖-1,6-二磷酸酶(fbp)基因或/和含有调控果糖-1,6-二磷酸酶(fbp)基因表达的物质或/和含有调控果糖-1,6-二磷酸酶(fbp)活性或含量的物质；

35、b8)含有转酮酶(tkt)基因或/和含有调控转酮酶(tkt)基因表达的物质或/和含有调控转酮酶(tkt)活性或含量的物质；

36、b9)含有转醛酶(tal)基因或/和含有调控转醛酶(tal)基因表达的物质或/和含有调控转醛酶(tal)活性或含量的物质；

37、b10)含有核糖-5-磷酸异构酶(rpi)基因或/和含有调控核糖-5-磷酸异构酶(rpi)基因表达的物质或/和含有调控核糖-5-磷酸异构酶(rpi)活性或含量的物质；

38、b11)含有磷酸核酮糖差向异构酶(rpe)基因或/和含有调控磷酸核酮糖差向异构酶(rpe)基因表达的物质或/和含有调控磷酸核酮糖差向异构酶(rpe)活性或含量的物质；

39、在本发明的一些具体实施例中，所述调控果糖二磷酸醛缩酶(fba)基因、果糖-1,6-二磷酸酶(fbp)基因、转酮酶(tkt)基因、转醛酶(tal)基因、核糖-5-磷酸异构酶(rpi)基因和磷酸核酮糖差向异构酶(rpe)基因的表达可为上调或增强或提高前述基因表达。更为具体的是，通过增加拷贝数的方式加强前述基因在受体菌中的表达。更为具体的是，通过替换强启动子的方式加强前述基因在受体菌中的表达。

40、上述受体菌为巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)，更为具体的是，前述巴斯德毕赤酵母(pichia past oris)为gs115菌株。

41、上述重组菌具有下述b12)-b11)中至少一种特征：

42、b12)不含有d-乳酸脱氢酶(ldh)基因或/和含有调控磷酸d-乳酸脱氢酶(ldh)基因表达的物质或/和含有调控d-乳酸脱氢酶(ldh)活性或含量的物质；

43、b13)不含有乙酰辅酶a水解酶(ach)基因或/和含有调控乙酰辅酶a水解酶(ach)基因表达的物质或/和含有调控乙酰辅酶a水解酶(ach)活性或含量的物质；

44、b14)不含有乙酰辅酶a合成酶(acs)基因或/和含有调控乙酰辅酶a合成酶(acs)基因表达的物质或/和含有调控乙酰辅酶a合成酶(acs)活性或含量的物质；

45、b15)不含有丙酮酸羧化酶(pdc)基因或/和含有调控丙酮酸羧化酶(pdc)基因表达的物质或/和含有调控丙酮酸羧化酶(pdc)活性或含量的物质。

46、上述重组菌为重组酵母，所述重组酵母通过对作为受体菌的酵母进行以下操作制备获得：

47、c1)导入丙氨酸脱氢酶(alad)基因或/和导入调控丙氨酸脱氢酶(alad)基因表达的物质或/和导入调控丙氨酸脱氢酶(alad)活性或含量的物质；

48、c2)导入醇氧化酶(aos)基因或/和导入调控醇氧化酶(aos)基因表达的物质或/和导入调控醇氧化酶(aos)活性或含量的物质；

49、c3)导入二羟基丙酮合成酶(das)基因或/和导入调控二羟基丙酮合成酶(das)基因表达的物质或/和导入调控二羟基丙酮合成酶(das)活性或含量的物质；

50、c4)导入二羟基丙酮激酶(dak)基因或/和导入调控二羟基丙酮激酶(dak)基因表达的物质或/和导入调控二羟基丙酮激酶(dak)活性或含量的物质；

51、c5)导入果糖磷酸丙糖异构酶(tpi)基因或/和导入调控果糖磷酸丙糖异构酶(tpi)基因表达的物质或/和导入调控果糖磷酸丙糖异构酶(tpi)活性或含量的物质；

52、c6)导入果糖二磷酸醛缩酶(fba)基因或/和导入调控果糖二磷酸醛缩酶(fba)基因表达的物质或/和导入调控果糖二磷酸醛缩酶(fba)活性或含量的物质；

53、c7)导入果糖-1,6-二磷酸酶(fbp)基因或/和导入调控果糖-1,6-二磷酸酶(fbp)基因表达的物质或/和导入调控果糖-1,6-二磷酸酶(fbp)活性或含量的物质；

54、c8)导入转酮酶(tkt)基因或/和导入调控转酮酶(tkt)基因表达的物质或/和导入调控转酮酶(tkt)活性或含量的物质；

55、c9)导入转醛酶(tal)基因或/和导入调控转醛酶(tal)基因表达的物质或/和导入调控转醛酶(tal)活性或含量的物质；

56、c10)导入核糖-5-磷酸异构酶(rpi)基因或/和导入调控核糖-5-磷酸异构酶(rpi)基因表达的物质或/和导入调控核糖-5-磷酸异构酶(rpi)活性或含量的物质；

57、c11)导入磷酸核酮糖差向异构酶(rpe)基因或/和导入调控磷酸核酮糖差向异构酶(rpe)基因表达的物质或/和导入调控磷酸核酮糖差向异构酶(rpe)活性或含量的物质；

58、c12)敲除编码d-乳酸脱氢酶(ldh)的基因；

59、c13)敲除编码乙酰辅酶a水解酶(ach)的基因；

60、c14)敲除编码乙酰辅酶a合成酶(acs)的基因；

61、c15)敲除编码丙酮酸羧化酶(pdc)的基因。

62、所述酵母可为毕赤酵母。所述毕赤酵母可为巴斯德毕赤酵母。

63、所述巴斯德毕赤酵母的基因组上含有表达3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydroge nase)、磷酸甘油酸激酶(phosphoglyceratekinase)、磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase)、烯醇化酶(enolase)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase)的编码基因。

64、上述重组菌中，所述丙氨酸脱氢酶(alad)基因来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌、球形芽孢杆菌或金黄色幽门螺杆菌。

65、上述重组菌中，

66、m1)所述丙氨酸脱氢酶(alad)为下述任一种：

67、m1-1)氨基酸序列为seq id no.7、seq id no.8或seq id no.9的蛋白质；

68、m1-2)将seq id no.7、seq id no.8或seq id no.9所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与丙氨酸脱氢酶(alad)相同功能的由m1-1)衍生的或与m1-1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；

69、m1-3)在m1-1)或m1-2)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

70、m2)所述醇氧化酶(aox)为下述任一种：

71、m2-1)氨基酸序列为seq id no.1的第940到2931位核苷酸编码的蛋白质；

72、m2-2)将m2-1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与醇氧化酶(aox)相同功能的由m2-1)衍生的或与m2-1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；

73、m2-3)在m2-1)或m2-2)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

74、m3)所述二羟基丙酮合成酶(das)为下述任一种：

75、m3-1)氨基酸序列为seq id no.2的第4863到6986位核苷酸编码的蛋白质；

76、m3-2)将m3-1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与二羟基丙酮合成酶(das)相同功能的由m3-1)衍生的或与m3-1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；

77、m3-3)在m3-1)或m3-2)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

78、m4)所述二羟基丙酮激酶(dak)为下述任一种：

79、m4-1)氨基酸序列为seq id no.3的第4863到6986位核苷酸编码的蛋白质；

80、m4-2)将m4-1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与二羟基丙酮激酶(dak)相同功能的由m4-1)衍生的或与m4-1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；

81、m4-3)在m4-1)或m4-2)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

82、m5)所述糖磷酸丙糖异构酶(tpi)为下述任一种：

83、m5-1)氨基酸序列为seq id no.4的第1001到1858位碱基编码的的蛋白质；

84、m5-2)将seq id no.56所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与果糖磷酸丙糖异构酶(tpi)相同功能的由m5-1)衍生的或与m5-1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；

85、m5-3)在m5-1)或m5-2)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

86、m6)所述果糖二磷酸醛缩酶(fba)为下述任一种：

87、m6-1)氨基酸序列为ncbi网站上reference sequence编号为xp_002489976.1的蛋白质；

88、m6-2)将m6-1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与果糖二磷酸醛缩酶(fba)相同功能的由m6-1)衍生的或与m6-1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；

89、m6-3)在m6-1)或m6-2)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

90、m7)所述果糖-1,6-二磷酸酶(fbp)为下述任一种：

91、m7-1)氨基酸序列为ncbi网站上reference sequence编号为xp_002493103.1的蛋白质；

92、m7-2)将m7-1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与果糖-1,6-二磷酸酶(fbp)相同功能的由m7-1)衍生的或与m7-1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；

93、m7-3)在m7-1)或m7-2)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

94、m8)所述转酮酶(tkt)为下述任一种：

95、m8-1)氨基酸序列为ncbi网站上reference sequence编号为xp_002490261.1的蛋白质；

96、m8-2)将m8-1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与转酮酶(tkt)相同功能的由m8-1)衍生的或与m8-1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；

97、m8-3)在m8-1)或m8-2)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

98、m9)所述转醛酶(tal)包括转醛酶tal1和转醛酶tal2，所述转醛酶tal1为下述任一种：

99、m9-1)氨基酸序列为ncbi网站上reference sequence编号为xp_002491849.1的蛋白质；

100、m9-2)将m9-1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与转醛酶tal1相同功能的由m9-1)衍生的或与m9-1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；

101、m9-3)在m9-1)或m9-2)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

102、所述转醛酶tal2为下述任一种：

103、m9-4)氨基酸序列为ncbi网站上reference sequence编号为xp_002491848.1的蛋白质；

104、m9-5)将m9-4)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与转醛酶tal2相同功能的由m9-4)衍生的或与m9-4)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；

105、m9-6)在m9-4)或m9-5)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

106、m10)所述核糖-5-磷酸异构酶(rpi)包括核糖-5-磷酸异构酶rpi1和核糖-5-磷酸异构酶rpi2，所述核糖-5-磷酸异构酶rpi1为下述任意一种：

107、m10-1)氨基酸序列为ncbi网站上reference sequence编号为xp_002493617.1的蛋白质；

108、m10-2)将m10-1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与核糖-5-磷酸异构酶rpi1相同功能的由m10-1)衍生的或与m10-1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；

109、m10-3)在m10-1)或m10-2)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

110、所述核糖-5-磷酸异构酶rpi2为下述任意一种：

111、m10-4)氨基酸序列为为ncbi网站上reference sequence编号为xp_002493618.1的蛋白质；

112、m10-5)将m10-4)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与核糖-5-磷酸异构酶rpi2相同功能的由m10-4)衍生的或与m10-4)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；

113、m10-6)在m10-4)或m10-5)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

114、m11)所述磷酸核酮糖差向异构酶(rpe)为下述任一种：

115、m11-1)氨基酸序列为seq id no.6中第941到1642位核苷酸编码的的蛋白质；

116、m11-2)将seq id no.6所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与磷酸核酮糖差向异构酶(rpe)相同功能的由m11-1)衍生的或与m11-1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；

117、m11-3)在m11-1)或m11-2)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

118、上述重组菌中：

119、c2)所述的物质为下述c2-1)或c2-2)：

120、c2-1)启动子或/和终止子，所述启动子或终止子来源于巴斯德毕赤酵母；

121、c2-2)启动子或终止子，所述启动子为核苷酸序列是seq id no.1的第1-939位的dna分子，所述终止子为核苷酸序列是seq id no.1的2932到3181位的dna分子；

122、c3)所述的物质为下述c3-1)或c3-2)：

123、c3-1)启动子或/和终止子，所述启动子或终止子来源于巴斯德毕赤酵母；

124、c3-2)启动子或终止子，所述启动子为核苷酸序列是seq id no.2的第1到4863位位的dna分子，所述终止子为核苷酸序列是seq id no.2的6987到7236位的dna分子；

125、c4)所述的物质为下述c4-1)或c4-2)：

126、c4-1)启动子或/和终止子，所述启动子或终止子来源于巴斯德毕赤酵母；

127、c4-2))启动子或/和终止子，所述启动子为核苷酸序列是sed id no.3的第1到1000位位的dna分子，所述终止子为核苷酸序列是sed id no.3的第2828到3077位的dna分子；

128、c5)所述的物质为下述c5-1)或c5-2)：

129、c5-1)启动子或/和终止子，所述启动子或终止子来源于巴斯德毕赤酵母；

130、c5-2)启动子或终止子，所述启动子为核苷酸序列是sed idno.4的第第1到1000位的dna分子，所述终止子为核苷酸序列是sed id no.4的第1859到2108位的dna分子；

131、c6)-c10)任一项所述的物质为下述c6-1)或c6-2)：

132、c6-1)启动子，所述启动子来源于多形汉逊酵母；

133、c6-2)启动子，所述启动子为核苷酸序列是seq id no.5的dna分子；

134、c11)所述的物质为下述c11-1)或c11-2)：

135、c11-1)启动子或/和终止子，所述启动子或终止子来源于多形汉逊酵母；

136、c11-2)启动子或/和终止子，所述启动子为核苷酸序列是seq id no.6的第1-940位碱基的dna分子，所述终止子为核苷酸序列是seq id no.6的第1643到1903位的dna分子。

137、前述重组菌在制备l-丙氨酸中的用途也属于本发明保护的范围。

138、本发明还提供了制备l-丙氨酸的方法，所述方法包括以前述重组菌作为发酵菌株并以甲醇为原料制备l-丙氨酸。

139、在一些具体实施例中，上述方法包括如下步骤：将前述重组菌接种于摇瓶，30℃培养1d，得到发酵液，将前述发酵液，收集菌体，将菌体重悬于含20ml转化培养基的100ml三角瓶中，30℃培养72h后，离心取上清过滤，收取滤液衍生化后进行hplc检测l-丙氨酸的含量。

140、本发明还提供了前述重组菌的制备方法，所述方法包括对受体菌进行如下操作：

141、1)用dna片段gcis1up-paox1-aox1-taox1-gcis1down替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是up-gcis1-down的第1-2023位核苷酸。也就是将醇氧化酶(aox)基因和含有调控醇氧化酶(aox)基因表达的启动子和终止子paox1-aox1-taox1(seq id no.1)导入巴斯德毕赤酵母gs115基因组中cis1整合位点，这里的整合为点是指komagataellaphaffii gs115 chromosome 1(ncbi编号：cp014715.1)上254264到254286位的碱基；

142、2)用dna片段gcis2up-pdas-das-tdas-gcis2down替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是up-gcis2-down的第1-2023位核苷酸，也就是将二羟基丙酮合成酶(das)基因和含有二羟基丙酮合成酶(das)基因表达的启动子和终止子pdas-das-tdas(seq idno.2)导入巴斯德毕赤酵母gs 115基因组中cis2整合位点，这里的整合为点是指komagataella phaffii gs115 chromosome 1(ncbi编号：cp014715.1)上321225到321247位的碱基；

143、3)用dna片段gcis3up-pdak-dak-tdak-gcis3down替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是up-gcis2-down的第1-2023位核苷酸。也就是将二羟基丙酮激酶(dak)基因和含有调控二羟基丙酮激酶(dak)基因表达的启动子和终止子pdak-dak-tdak(seq idno.3)导入巴斯德毕赤酵母gs115基因组中cis3整合位点，这里的整合为点是指komagataella phaffii gs115 chromosome 2(ncbi编号：cp014716.1)上1544804到1544826位的碱基；

144、4)用dna片段gcis4up-ptpi-tpi-ttpi-gcis4down替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是up-gcis4-down的第1-2023位核苷酸。也就是将磷酸丙糖异构酶(tpi)基因和含有调控磷酸丙糖异构酶(tpi)基因表达的启动子和终止子ptpi-tpi-ttpi(seq idno.4)导入巴斯德毕赤酵母gs115基因组中cis4整合位点，这里的整合为点是指komagataella phaffii gs115 chromosome 2(ncbi编号：cp014716.1)上1552137到1552159位的碱基；

145、5)用dna片段pfbaup-pmox-fba替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是fba基因起始密码子上游的第1-300位核苷酸(komagataella phaffii gs115 chromosome1(ncbi编号：cp014715.1)上680694到680993位的碱基)。也就是将增强果糖二磷酸醛缩酶(fba)基因表达的启动子pmox(seq id no.5)导入巴斯德毕赤酵母gs115基因组中fba编码基因上游第1-300位核苷酸处原有启动子序列；

146、6)用dna片段pfbpup-pmox-fbp替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是fbp基因起始密码子上游的第1-100位核苷酸(komagataella phaffii gs115 chromosome3(ncbi编号：cp014717.1)上1697875到1697974位的碱基)。也就是将增强果糖-1,6-二磷酸酶(fbp)基因表达的启动子pmox(seq id no.5)导入巴斯德毕赤酵母gs115基因组中fbp编码基因上游第1-100位核苷酸处替换原有启动子序列；

147、7)用的dna片段ptktup-pmox-tkt替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是tkt基因起始密码子上游的第1-100位核苷酸(komagataella phaffii gs115chromosome 1(ncbi编号：cp014715.1)上1682435到1682534位的碱基)。也就是将增强转酮酶(tkt)基因表达的启动子pmox(seq id no.5)导入巴斯德毕赤酵母gs115基因组中tkt编码基因上游第1-100位核苷酸处替换原有启动子序列；

148、8)用dna片段ptal1up-pmox-tal1替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是tal1基因起始密码子上游的第1-100位核苷酸(komagataella phaffii gs115chromosome 2(ncbi编号：cp014716.1)上1753041到1753140位的碱基)。也就是将增强转醛酶1(tal1)基因表达的启动子pmox(seq idno.5)导入巴斯德毕赤酵母gs115基因组中tal1编码基因上游第1-100位核苷酸处替换原有启动子序列；用dna片段ptal2up-pmox-tal2替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是tal2基因起始密码子上游的第1-80位核苷酸(komagataella phaffii gs115 chromosome 2(ncbi编号：cp014716.1)上1751671到1751750位的碱基)。也就是将增强转醛酶1(tal2)基因表达的启动子pmox(seq id no.5)导入巴斯德毕赤酵母gs115基因组中tal2编码基因上游第1-80位核苷酸处替换原有启动子序列；

149、9)用dna片段prpi1up-pmox-rpi1替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是rpi1基因起始密码子上游的第1-100位核苷酸(komagataella phaffii gs115chromosome 4(ncbi编号：cp014718.1)上469130到469229位的碱基)。也就是将增强核糖-5-磷酸异构酶1(rpi1)基因表达的启动子pmox(seq id no.5)导入巴斯德毕赤酵母gs115基因组中rpi1编码基因上游第1-100位核苷酸处替换原有启动子序列；用dna片段prpi2up-pmox-rpi2替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是rpi2基因起始密码子上游的第1-90位核苷酸(komagataella phaffii gs115 chromosome 4(ncbi编号：cp014718.1)上470003到470092位的碱基)。也就是将增强核糖-5-磷酸异构酶2(rpi2)基因表达的启动子pmox(seq id no.5)导入巴斯德毕赤酵母gs115基因组中rpi1编码基因上游第1-90位核苷酸处替换原有启动子序列；

150、10)用dna片段gcis5up-paox1-oprpe-taox1-gcis5down替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是up-gcis5-down的第1-2023位核苷酸。也就是将磷酸核酮糖差向异构酶(rpe)基因和含有调控磷酸核酮糖差向异构酶(rpe)基因表达的启动子和终止子paox1-oprpe-taox1(seq id no.6)导入巴斯德毕赤酵母gs115基因组中cis5整合位点，这里的整合为点是指komagataella phaffii gs115 chromosome 2(ncbi编号：cp014716.1)上1620536到1620558位的碱基；

151、11)用dna片段ldhup-ldhdown替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是ldh基因上游1000bp至ldh基因下游1000bp的核苷酸(komagataella phaffii gs115chromosome 3(ncbi编号：cp014717.1)上1295557到1299253位的碱基)得到的重组毕赤酵母，从而将巴斯德毕赤酵母中的d-乳酸脱氢酶(ldh)基因敲除；

152、12)用dna片段achup-achdown替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是ach基因上游1000bp至ach基因下游1000bp的核苷酸(komagataella phaffii gs115chromosome 3(ncbi编号：cp 014717.1)上507236到510807位的碱基)得到的重组毕赤酵母，从而将巴斯德毕赤酵母中的乙酰辅酶a水解酶(ach)基因敲除。

153、13)用dna片段acs1up-acs1down替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是acs1基因上游1000bp至acs1基因下游1000bp的核苷酸(komagataella phaffii gs115chromosome 2(ncbi编号：cp014716.1)上1460472到1464478位的碱基)得到的重组毕赤酵母，从而将巴斯德毕赤酵母中的乙酰辅酶a合成酶1(acs1)基因敲除；用dna片段acs2up-acs2down替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是acs2基因上游1000bp至acs2基因下游1000bp的核苷酸(komagataella phaffii gs115 chromosome 3(ncbi编号：cp014717.1)上788667到792685位的碱基)得到的重组毕赤酵母，从而将巴斯德毕赤酵母中的乙酰辅酶a合成酶2(acs2)基因敲除。

154、14)用dna片段pdcup-pdcdown替换巴斯德毕赤酵母gs115基因组中核苷酸序列是pdc基因上游1000bp至pdc基因下游1000bp的核苷酸(komagataella phaffii gs115chromosome 3(ncbi编号：cp 014717.1)上382554到386236位的碱基)得到的重组毕赤酵母，从而将巴斯德毕赤酵母中的丙酮酸羧化酶(pdc)基因敲除。

155、15)将seq id no.7的序列导入巴斯德毕赤酵母gs115，从而使巴斯德毕赤酵母gs115表达嗜热脂肪地芽孢杆菌来源的丙氨酸脱氢酶(gsalad)。

156、本发明提供的重组菌，含有如下的一种或多种遗传修饰：(1)甲醇或甲醛同化途径的增强，包括引入或加强醇氧化酶、二羟基丙酮合成酶、二羟基丙酮激酶和果糖磷酸丙糖异构酶；(2)五碳化合物回补途径的增强，包括引入或加强果糖二磷酸醛缩酶、果糖-1,6-二磷酸酶、转酮酶、转醛酶、磷酸核酮糖差向异构酶、核糖-5-磷酸异构酶；(3)引入或加强丙氨酸脱氢酶；(4)副产物产生相关基因敲除。所述工程菌株具有将甲醇、甲醛原料转化为l-丙氨酸的能力。该菌株可利用甲醇、甲醛合成l-丙氨酸。