重组erIL-15NK细胞的制作方法

本披露涉及表达il-15的经基因修饰的免疫细胞，尤其是当这些经基因修饰的免疫细胞涉及表达且在细胞内保留经修饰的il-15并进一步表达cd16的高亲和力变体和car(嵌合抗原受体)中的至少一种的nk细胞时。

背景技术：

1、背景技术描述包括在理解本披露中可能有用的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

2、本文中的所有出版物和专利申请都通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指明通过引用并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。

3、nk-92细胞在基于细胞的疗法的各个方面都是理想的，因为它们对受体中的同种异体细胞缺乏明显的毒性，且对范围广泛的肿瘤细胞具有相对广泛的细胞毒性活性谱。此外，nk-92细胞可以以相对简单的方式培养，且因此是过继性癌症免疫疗法的一个有吸引力的选择。不幸的是，nk-92细胞的增殖和功能高度依赖于il-2，这在大规模需要nk-92细胞时增加了成本。为了避免与此类细胞因子需求相关的问题，nk-92细胞已被转化为表达且在细胞内保留il-2(参见例如，exp hematol[实验血液学]33:159-164)。虽然此类经修饰的细胞确实变得不依赖于外源性细胞因子，但仍存在各种缺点。除其他外，在将此类细胞用于哺乳动物中的情况下，此类经修饰的细胞释放的il-2可增加il-2介导的体内效应，当il-2刺激肿瘤微环境中的免疫抑制(典型地通过骨髓源性抑制细胞(mdsc)和t调节细胞(treg)的生长和扩增来刺激)时，这是特别不希望的。

4、在另一个实例中，由克隆到pcdna3表达载体中的cdna转染nk-92细胞以表达il-15(参见例如，haematologica[血液学],2004；89:338-347)，且如此转染的细胞在培养上清液中持续产生高水平的il-15，这被认为可以使细胞响应于低剂量il-2或il-15的刺激而显著更快地增殖。此外，长期培养中细胞的累积数量也显著高于未转染的细胞。然而，在体内使用此类细胞的情况下，高水平的分泌il-15可能会出现临床问题。

5、类似地，使用病毒转染系统转化nk-92细胞，以表达il-15的重组天然形式(参见例如，cancer immunol immunother[癌症与免疫治疗](2012)61:1451-1461)。虽然此类重组细胞能够在没有外源性细胞因子的情况下生长并表达重组car，但转染效率相对较低，在细胞内产生相对低量的il-15，且向培养基中分泌低量的il-15。此外，与亲代nk-92细胞系相比，重组细胞的细胞毒性降低。值得注意的是，在由质粒表达相同的il-15的情况下，如此产生的nk-92细胞并非完全不依赖于外源性生长因子，因此限制了此类重组细胞的体内使用。

6、因此，即使本领域已知各种经修饰的免疫细胞，尤其是经修饰的nk细胞，但它们中的所有或几乎所有都存在各种缺点。因此，需要提供改进的经修饰的nk细胞，其在保持靶向细胞毒性的同时，表现出理想的生长特性。

技术实现思路

1、本文披露了各种重组细胞、组合物和方法，其中nk细胞经基因修饰以在细胞内表达且分泌或呈递il-15或其变体，从而使经修饰的nk细胞不依赖于外源性细胞因子，且允许刺激/活化靠近修饰的nk细胞的其他免疫感受态细胞。

2、在本发明主题的一个方面中，诸位发明人考虑了一种经基因修饰的nk细胞和制备此类细胞的方法，其中该经基因修饰的nk细胞包含含有编码erlsp-il-15的第一区段的重组核酸。最典型地，该nk细胞是nk-92细胞，且该重组核酸是dna(例如，线性化质粒)。优选地，但非必需地，erlsp-il-15中的il-15部分包含密码子优化的人il-15序列。

3、在进一步的实施例中，该重组核酸进一步包含编码cd16的第二区段或高亲和力cd16，和/或可进一步包含编码嵌合抗原受体的第三区段，和/或可进一步包含编码干扰检查点抑制的蛋白质、提供免疫刺激的蛋白质、结合/抑制与免疫抑制有关的细胞因子的蛋白质和/或il-15受体α链的第四区段。还考虑到重组核酸包含具有足够强度的启动子，以便驱动erlsp-il-15以足以(a)使经修饰的nk细胞不依赖于外源性细胞因子以及(b)允许刺激/活化靠近经修饰的nk细胞的其他免疫感受态细胞的量表达。任选地，该经修饰的nk细胞可包含经由cd16偶联到该细胞的抗体。

4、在本发明主题的进一步的方面中，诸位发明人还考虑了包含药学上可接受的载体与本文所述的经基因修饰的nk细胞的组合的药物组合物。最典型地，此类组合物将被配制成用于输注给患者，且每剂量单位可包含至少1x 109个细胞。

5、因此，诸位发明人还考虑了本文所述的经基因修饰的nk细胞在治疗癌症中的用途。虽然此用途可能是作为独立治疗的细胞输注，但其他考虑到的用途还包括施用突破到tme中的药物、施用减少免疫抑制的药物、施用刺激免疫感受态细胞的药物、施用癌症疫苗组合物、和/或施用有助于维持免疫应答和促进记忆细胞发育的药物。

6、从以下对优选实施例的详细描述以及附图中，各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显，在附图中相同的数字表示相同的组成部分。

技术特征：

1.一种重组核酸，其包含编码erlsp-il-15的第一区段，其中所述核酸包含seq id no:4。

2.根据权利要求1所述的重组核酸，其中所述重组核酸选自dna、多顺反子dna构建体、质粒、病毒载体、rna以及线性化质粒。

3.根据权利要求1或2所述的重组核酸，其中所述重组核酸还包含编码cd16或高亲和力cd16的第二区段。

4.根据权利要求1或2所述的重组核酸，其中所述重组核酸还包含编码嵌合抗原受体的第三区段。

5.根据权利要求1或2所述的重组核酸，其中所述重组核酸还包含编码干扰检查点抑制的蛋白质、提供免疫刺激的蛋白质、结合和抑制与免疫抑制有关的细胞因子的蛋白质和/或il-15受体α链的第四区段。

6.根据权利要求1或2所述的重组核酸，其中所述erlsp-il-15中的il-15部分包含密码子优化的人il-15序列。

7.一种在体外基因修饰免疫细胞的方法，所述方法包括：将重组核酸引入所述免疫细胞中，以获得经基因修饰的免疫细胞，其中所述重组核酸包含编码erlsp-il-15的第一区段，其中所述第一区段包含seq id no:4。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述免疫细胞是抗原呈递细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是树突状细胞。

10.根据权利要求7所述的方法，其中所述免疫细胞是自然杀伤(nk)细胞。

11.根据权利要求7所述的方法，其中所述重组核酸是病毒载体。

12.根据权利要求7所述的方法，其中所述重组核酸是rna分子。

13.根据权利要求7所述的方法，其中所述重组核酸是线性化质粒。

14.根据权利要求7所述的方法，其中所述重组核酸还包含编码cd16或高亲和力cd16的第二区段。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述重组核酸还包含编码嵌合抗原受体的第三区段。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述重组核酸还包含编码干扰检查点抑制的蛋白质、提供免疫刺激的蛋白质、结合/抑制与免疫抑制有关的细胞因子的蛋白质和/或il-15受体α链的第四区段。

17.根据权利要求7所述的方法，其中所述重组核酸包含具有足够强度的启动子，以便驱动所述erlsp-il-15以足以允许刺激/活化靠近所述经基因修饰的免疫细胞的其他免疫感受态细胞的量表达。

18.根据权利要求7所述的方法，其中所述erlsp-il-15中的il-15部分包含密码子优化的人il-15序列。

19.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体与根据权利要求7-18中任一项所限定的经基因修饰的免疫细胞的组合。

20.根据权利要求19所述的药物组合物，所述药物组合物被配制成用于输注给患者。

21.根据权利要求19所述的药物组合物，所述药物组合物每剂量单位包含至少5x 107个细胞。

22.一种药物组合物，其用于治疗癌症，所述组合物包含根据权利要求7-18中任一项所限定的经基因修饰的免疫细胞。

23.一种药物组合物，其用于制备用于刺激细胞介导的免疫应答的药物，所述组合物包含经基因修饰的自然杀伤nk细胞，所述经基因修饰的自然杀伤nk细胞包含含有第一区段的重组核酸，所述第一区段编码由seq id no：5所示的白细胞介素-15(il-15)的长信号肽lsp变体，其中所述变体包含内质网保留信号erlsp-il-15。

24.根据权利要求23所述的组合物，其还包含选自突破到肿瘤微环境(tme)中的药物、减少免疫抑制的药物、刺激免疫感受态细胞的药物、癌症疫苗和促进记忆细胞发育的至少一种药物的制剂。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述突破到tme中的药物包括阿伐沙林。

26.根据权利要求24所述的组合物，其中所述减少免疫抑制的药物是环磷酰胺。

27.根据权利要求24所述的组合物，其中所述刺激免疫感受态细胞的药物是alt-803。

28.根据权利要求24所述的组合物，其中所述癌症疫苗是基于腺病毒v(adv)的疫苗，其包含编码肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或新抗原中的至少一种的核酸。

29.根据权利要求24所述的组合物，其中所述促进记忆细胞发育的药物是肿瘤靶向il-12融合构建体。

30.根据权利要求23所述的组合物，其中所述nk细胞被配制成用于静脉(iv)施用。

31.根据权利要求23所述的组合物，其中所述nk细胞被配制成以5×107个细胞/剂量iv至5×1010个细胞/剂量iv的剂量施用。

技术总结提出了提供改进的NK细胞功能的系统和方法。在优选的方面，NK‑92细胞表达重组er/LSP‑IL‑15，从而使这些NK‑92细胞不依赖于外源性细胞因子且提供细胞外免疫刺激。技术研发人员：派翠克·松吉翁,沙赫鲁兹·拉比扎德,卡伊万·尼亚兹,汉斯·克林格曼受保护的技术使用者：河谷细胞有限公司技术研发日：技术公布日：2024/12/2