核酸构建体的制作方法

发明领域本发明涉及用于调节转基因相对表达的构建体和方法。

背景技术：

0、发明背景

1、多个转基因的表达

2、基因治疗涉及细胞的修饰以表达生物分子从而治疗或纠正病理状况。获得生理或治疗相关水平的生物分子是成功进行基因治疗的关键。

3、当前用于调节基因表达的方法通常依赖于修饰启动子区域以增加或降低转录速率或在其中插入调控元件以通过工程化转录因子和小分子的作用使它们的表达可诱导。

4、基因治疗方法通常涉及多于一个转基因的表达。用多种载体转导细胞以产生多种产物是困难、昂贵和不可预测的。因此，已经开发出各种方法以允许从单个载体共表达两种蛋白质(参见图1)。

5、最初的尝试是在同一表达盒中使用两种不同的启动子，这会产生两个独立的转录物，每个转录物编码独立的蛋白质。由于多种原因，这是一种困难的方法。一个关键问题是“启动子干扰”，即一个启动子占主导并导致第二个启动子沉默。另外，不同的启动子在不同的细胞环境中的运作不同，这使得难以实现每个转基因相对表达的一致“调节”。

6、替代方法是使用内部核糖体进入序列(ires)。在这里，生成单个转录物。转录物中的ires序列位于两个转基因的开放阅读框之间，并模拟mrna帽结构。因此，核糖体在5'帽或ires处开始翻译，从而导致两种独立蛋白质的表达。该方法的关键限制是无法控制相对表达。3'转录物的表达通常少于5'转录物，但表达比例很难预测和调整。

7、根据口蹄疫病毒(fmdv)2a肽在允许fmdv(及相关病毒)由单个开放阅读框(orf)表达多种蛋白质中的作用的特征，已经开发出另一种方法(donnelly et al；j.gen.virol.；82,1027–1041(2001))。2a肽(和同源物)在orf翻译后立即以极高的效率切割，从而使得可以由单个orf表达多种肽。自切割肽如2a肽的使用导致转基因以1:1的比例表达。

8、wo2016/174409描述了使用改变的信号肽来改变核酸构建体内转基因表达的比例。在该系统中，将突变引入例如i型跨膜蛋白的信号肽基序中，以降低运输至细胞表面的效力。与野生型信号肽基序相比，这种方法可使细胞表面表达水平降低约10倍。

9、然而，这种策略仅适用于降低细胞表面蛋白的表达，因为它通过减少蛋白质向细胞表面的运输而起作用。此外，表达降低10倍可能不足以用于某些应用，例如有毒化合物的表达，在这些应用中，过表达可导致宿主细胞死亡。

10、因此，需要改变细胞中两个或多个转基因的相对表达的与这些限制无关的替代方法。

11、嵌合抗原受体(car)

12、嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)疗法通过在细胞表面表达识别肿瘤特异性抗原的嵌合抗原受体(car)，使溶细胞性t细胞重定向至靶肿瘤细胞。嵌合抗原受体由抗体或配体结合基序、间隔区结构域和跨膜结构域组成，这些序列与t细胞受体(tcr)的cd3ζ链的细胞内信号传导结构域融合。来自共受体例如cd28、ox40或4-1bb的信号传导结构域，也可与cd3ζ信号传导结构域一起包含在car 1中。

13、car-t细胞疗法已被证明是治疗血液恶性肿瘤如b细胞白血病的有效疗法，其获得了令人印象深刻的应答率。但是，car-t细胞疗法未能在实体瘤的治疗中取得同样的成功，其中一些因素复合限制了car-t细胞的活性。这些因素包括免疫抑制性配体如pd-l1的表达，抑制有利的炎症反应的细胞因子的分泌，诱导肿瘤细胞凋亡和营养消耗的配体的表达。为了克服免疫抑制性肿瘤微环境，将car-t细胞改造成表达阻断免疫抑制信号传导或能够使t细胞在敌对的肿瘤微环境中存活的分子。

14、增强炎症反应的细胞因子可以提高car-t细胞疗法的疗效。这些细胞因子包括il-7、il-12、il15、il-17a、il-18和il-21，它们在外源提供时或在car t细胞治疗期间释放时显示出增强car-t细胞的应答。

15、il-12是有效的免疫调节细胞因子，通常由吞噬细胞和树突状细胞分泌，以响应：病原体；t细胞信号和自然杀伤(nk)细胞信号；以及细胞外基质成分。car-t细胞已被改造为组成型地或从诱导型启动子表达il-12，这已显示出在靶向实体瘤时改善car-t细胞疗法的功效。il-12具有全身毒性，因此已对car t细胞或其他免疫细胞进行了改造，以使il-12释放到肿瘤微环境1中。但是，转基因t细胞il-12分泌可导致高毒性全身水平。

16、尽管细胞因子、趋化因子或毒素的表达可改善car-t细胞疗法的疗效，但必须严格调节这些生物分子的分泌，以将它们的毒性限制在提供治疗益处和最小副作用的安全水平之内。这可以通过插入或删除顺式作用序列以获得期望的转录水平或将可诱导元件引入启动子区域来调节从启动子区域转录基因的速率来实现。值得注意的诱导型启动子系统包括四环素关闭(tet-off)系统和四环素关闭(tet-off)系统，它们利用四环素反应元件(tre)与工程化形式的四环素阻遏蛋白(tetr)，其与tre的19bp核苷酸序列结合2。在四环素关闭系统中，tetr与单纯疱疹病毒的viron蛋白16(vp16)的反式激活结构域融合，从而生成四环素反式激活因子(tta)。在缺乏四环素的情况下，tta在启动子区域中与tre结合并增强基因转录；相反地，在存在四环素的情况下，tta不能与tre结合并且转录不会发生。tta中tetr结构域的突变使其依赖四环素以与tre结合，从而在系统上产生反向tta(rtta)和四环素。在存在四环素的情况下，rtta能够与tre结合并刺激转录，但在不存在时却不能。尽管四环素诱导系统能够控制转基因表达，但它依赖于小分子的使用、在启动子序列中插入tre以及tta或rtta的表达，这给细胞带来了沉重负担。

17、控制基因表达的替代方法是使用内部核糖体进入位点(ires)。如上所述，ires置于主要转基因的下游，并促进水平通常低于主要转基因的其他转基因的组成型表达。这种方法已用来在car-t细胞中组成型表达il-12，以试图增强免疫应答并避免在输注car-t细胞之前对宿主进行预处理。然而，il-12的表达水平是不可预测的，并且在体内仍然可能是有毒的。

18、因此，需要与上述缺点无关的用于使嵌合抗原受体与例如细胞因子、趋化因子或毒素的分子共表达的替代方法。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明人已经开发出使用框滑动或翻译连读作为调节转基因表达的手段的系统。特别地，该系统可用于控制从单个mrna转录物表达两个或更多个转基因的相对表达。

2、因此，在第一方面，本发明提供了核酸构建体，其包含：第一目的核苷酸序列(noi1)；框滑动基序或翻译连读基序(fsm/trm)；和第二目的核苷酸序列(noi2)。

3、核酸构建体还可包含编码切割位点(cl)的核苷酸序列，从而使noi1和noi2表达为独立的蛋白质。

4、核酸构建体可包含以下结构：

5、noi1–fsm/trm-cl–noi2或noi1-cl-fsm/trm-noi2。

6、特别地，核酸构建体包含以下结构：

7、noi1–cl-fsm–noi2；或

8、noi1-trm-cl-noi2。

9、核酸构建体可包含2个以上目的核苷酸序列。例如，核酸构建体可具有以下结构：

10、noi1–fsm1/trm1-cl1–noi2-fsm2/trm2-cl2-noi3，或

11、noi1–cl1-fsm1/trm1–noi2-cl2-fsm2/trm2-noi3

12、其中：

13、noi1、noi2和noi3是目的核苷酸序列；

14、fsm1/trm1和fsm2/trm2可以相同或不同，是框滑动基序或翻译连读基序；和

15、cl1和cl2可以相同或不同，是各自编码切割位点的核酸序列。

16、框滑动基序(fsm)可包含尿嘧啶、胸腺嘧啶或鸟嘌呤碱基的重复，例如序列uuuuuuu(seq id no.1)。

17、框滑动基序还可包含终止密码子。例如，fsm可包含以下序列之一：

18、uuuuuuuga(seq id no.2)

19、uuuuuuuag(seq id no.3)

20、uuuuuuuaa(seq id no.4)。

21、翻译连读基序(trm)可包含序列stop-cuag或stop-caauua，其中“stop”是终止密码子。例如，翻译连读基序可包含以下序列之一：

22、uga-cuag(seq id no.5)

23、uag-cuag(seq id no.6)

24、uaa-cuag(seq id no.7)

25、uga-caauua(seq id no.8)

26、uag-caauua(seq id no.9)

27、uaa-caauua(seq id no.10)

28、包含翻译连读基序的核酸构建体可包含两个相邻的可以相同或不同的trm。

29、包含翻译连读基序的核酸构建体可包含各自编码切割位点的两个核酸序列。trm可位于两个切割位点编码序列之间，或者可以存在两个trm，每个trm位于切割位点的上游。

30、包含翻译连读基序的核酸构建体可包含位于第二(或后续)目的核苷酸上游的减弱或低效的信号肽。

31、包含翻译连读基序的核酸构建体可具有以下序列之一：

32、noi1–trm-cl–noi2

33、noi1-trm1-trm2-cl-noi2

34、noi1-cl1-trm-cl2-noi2

35、noi1-trm-cl-sp-noi2

36、noi1–trm1-cl1–noi2-trm2-cl2-noi3

37、noi1–trm1-cl1-trm2-cl2–noi2

38、其中：

39、trm1和trm2可以相同或不同，是第一翻译连读基序和第二翻译连读基序；

40、cl1和cl2可以相同或不同，是各自编码切割位点的第一核酸序列和第二核酸序列；

41、sp是减弱的信号肽；和

42、noi3是第三目的核苷酸序列。

43、切割位点可例如包含自切割肽、弗林蛋白酶切割位点或烟草蚀刻病毒切割位点。

44、切割位点可例如包含来自口蹄病毒或心脏病毒的2a自切割肽或2a样肽。

45、第二(或后续)目的核苷酸可编码细胞因子、趋化因子或毒素。

46、核酸构建体在细胞中表达时，可以能够产生两种产物：

47、a)仅由noi1编码的第一产物；和

48、b)由noi1和noi2编码的第二产物，该第二产物在发生框滑动或翻译连读时产生。

49、在该实施方案中,第二产物可以是嵌合抗原受体(car)，并且第一产物可以是car的截短形式，其无法诱导car介导的细胞信号传导。

50、替代地，第一产物可以是包含细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(car，即第一代car)，并且第二产物是包含细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域的car(即第二代或第三代car)。

51、在第二方面,本发明提供了包含根据本发明第一方面的核酸构建体的载体。

52、载体可以例如是逆转录病毒载体或慢病毒载体。

53、在第三方面,本发明提供了包含根据本发明第一方面的核酸构建体或根据本发明第二方面的载体的细胞。

54、在第四方面,本发明提供了用于制备根据本发明第三方面的细胞的方法，其包括将根据本发明第一方面的核酸构建体或根据本发明第二方面的载体引入细胞中的步骤。

55、在第五方面，本发明提供了用于调节核酸构建体中两个转基因的相对表达的方法，该方法包括以下步骤：在两个转基因之间引入框滑动基序或翻译连读基序，以减少下游转基因的表达。

56、使用框滑动或翻译连读作为控制转基因表达的手段的明显优势在于可实现广泛的表达，在表达两个转基因的情况下，第二转基因的表达水平可降低至小于第一转基因的1％。这大大低于使用改变的信号肽所能达到的水平，并使该技术可用于表达蛋白质例如有毒化合物，其中极低的表达水平是必需的。

57、框滑动或翻译连读的使用使得转基因以可预测且确定的比率表达。也可以通过使用不同的框滑动基序或连读基序来调节转基因的表达水平。

58、该系统可用于控制任何转基因的表达，并且不限于细胞表面蛋白的表达。

59、本技术还涉及以下实施方案：

60、1、一种核酸构建体，其包含：第一目的核苷酸序列(noi1)；框滑动基序(fsm)或翻译连读基序(trm)；和第二目的核苷酸序列(noi2)。

61、2、根据实施方案1所述的核酸构建体，其还包含编码切割位点(cl)的核苷酸序列，从而使noi1和noi2表达为独立的蛋白质。

62、3、根据实施方案2所述的核酸构建体，其具有以下结构：

63、noi1-cl-fsm-noi2；或

64、noi1-trm-cl-noi2。

65、4、根据前述实施方案中任一项所述的核酸构建体，其包含框滑动基序(fsm)，该框滑动基序包含尿嘧啶、胸腺嘧啶或鸟嘌呤碱基的重复。

66、5、根据实施方案4所述的核酸构建体，其中所述fsm包含序列uuuuuuu(seq idno.1)。

67、6、根据实施方案4或5所述的核酸构建体，其中所述fsm还包含终止密码子。

68、7、根据实施方案6所述的核酸构建体，其中所述fsm包含以下序列之一：

69、uuuuuuuga(seq id no.2)

70、uuuuuuuag(seq id no.3)

71、uuuuuuuaa(seq id no.4)。

72、8、根据实施方案1至3中任一项所述的核酸构建体，其包含翻译连读基序(trm)，该翻译连读基序包含序列stop-cuag或stop-caauua，其中“stop”是终止密码子。

73、9、根据实施方案8所述的核酸构建体，其中所述翻译连读基序包含以下序列之一：

74、uga-cuag(seq id no.5)

75、uag-cuag(seq id no.6)

76、uaa-cuag(seq id no.7)

77、uga-caauua(seq id no.8)

78、uag-caauua(seq id no.9)

79、uaa-caauua(seq id no.10)。

80、10、根据实施方案8或9所述的核酸构建体，其具有以下结构：

81、noi1-trm-cl-noi2

82、noi1-trm1-trm2-cl-noi2

83、noi1-cl1-trm-cl2-noi2

84、noi1-trm-cl-sp-noi2

85、noi1-trm1-cl1-noi2-trm2-cl2-noi3

86、noi1-trm1-cl1-trm2-cl2-noi2

87、其中：

88、trm1和trm2可以相同或不同，是第一翻译连读基序和第二翻译连读基序；

89、cl1和cl2可以相同或不同，是各自编码切割位点的第一核酸序列和第二核酸序列；

90、sp是减弱的信号肽；和

91、noi3是第三目的核苷酸序列。

92、11、根据实施方案2至10所述的核酸构建体，其中所述切割位点包含自切割肽、弗林蛋白酶切割位点或烟草蚀刻病毒切割位点。

93、12、根据实施方案11所述的核酸构建体，其中所述切割位点包含来自口蹄病毒或心脏病毒的2a自切割肽，或2a样肽。

94、13、根据前述实施方案中任一项所述的核酸构建体，其中noi2编码细胞因子、趋化因子或毒素。

95、14、根据实施方案1所述的核酸构建体，其在细胞中表达时能够产生两种产物：

96、a)仅由noi1编码的第一产物；和

97、b)由noi1和noi2编码的第二产物，该第二产物在发生框滑动或翻译连读时产生。

98、15、根据实施方案14所述的核酸构建体，其中所述第二产物是嵌合抗原受体(car)，并且所述第一产物是所述car的截短形式，其无法诱导car介导的细胞信号传导。

99、16、根据实施方案14所述的核酸构建体，其中所述第一产物是包含细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(car)，并且所述第二产物是包含细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域的car。

100、17、一种载体,其包含根据前述实施方案中任一项所述的核酸构建体。

101、18、根据实施方案17的逆转录病毒载体或慢病毒载体。

102、19、一种细胞，其包含根据实施方案1至16中任一项所述的核酸构建体或根据实施方案17或19所述的载体。

103、20、一种用于制备根据实施方案19所述的细胞的方法，其包括将根据实施方案1至16中任一项所述的核酸构建体或根据实施方案17或18所述的载体引入细胞中的步骤。

104、21、一种用于调节核酸构建体中两个转基因的相对表达的方法，其包括在所述两个转基因之间包括框滑动基序或翻译连读基序以减少下游转基因的表达的步骤。