一种特异性识别家蚕微孢子虫的核酸适配体及其应用

本发明属于家蚕病害检测，具体涉及一种特异性识别家蚕微孢子虫的核酸适配体及其应用。

背景技术：

1、家蚕微粒子病是由家蚕微孢子虫(nosema bombycis，n.b)专性寄生家蚕(bombyxmori)引发的一种传染性病害。由于其可经食下传染和胚种垂直传染，给蚕业生产尤其是蚕种生产造成严重威胁，被各养蚕国家和地区列为蚕种生产的唯一检疫对象，严重影响了蚕桑产业的可持续稳定发展。简便、快速、精准的检测方法是预防家蚕微粒子病大爆发并减少经济损失的先决条件。

2、目前，诊断家蚕微粒子病的方法主要有显微镜检、免疫学检测和分子生物学检测等方法。传统的显微镜镜检因无法区分形态相似的病原所以容易造成误检、漏检；免疫学检测对微孢子虫的需要量大，抗体制备繁琐、容易失活变性。分子生物学检测对仪器设备和检测人员要求颇高，操作复杂，损时耗资，不适于在生产中推广应用。因此，如何建立一种高精确度、高特异性、检测效率高的家蚕微孢子虫检测技术，是目前亟待解决的问题。

3、核酸适配体(aptamer)是一段人工合成的、能特异性识别相应靶标并与之亲和结合的单链dna、rna或核酸类似物(xna)，通常采用指数富集系统进化技术(systematicevolution of ligands by exponential enrichment，selex)筛选获得，具有与抗体相当甚至更高的亲和性，故又称“化学抗体”。与传统的生物学方法获得的抗体相比，核酸适配体可快速大量合成，无批次间差异且成本低；可以有多种化学修饰，与多种信号转导平台相结合开发分析检测方法等优点。将核酸适配体作为靶标识别元件，已被成功的应用于临床医学、畜牧兽医等多种病原的快速、准确检测。

4、目前，通过selex技术已经成功筛选到以蛋白质、激素、生物毒素等为靶标的核酸适配体，将病原微生物作为靶标筛选的相关报道还比较少，且主要以病毒和细菌为主。微孢子虫作为一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物，结构非常复杂，针对其核酸适配体的筛选及应用研究目前尚未见报道。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种特异性识别家蚕微孢子虫的核酸适配体及其应用。基于本发明的核酸适配体，能够实现对家蚕微孢子虫的快速、准确和特异性检测，对于家蚕微粒子病的预防具有重要的意义。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种特异性识别家蚕微孢子虫的核酸适配体，所述核酸适配体具有如下(1)或(2)所示的序列：

4、(1)seq id no.1所示的序列

5、(2)与seq id no.1互补的序列。

6、本发明的第二方面，提供上述核酸适配体在如下(1)或(2)中的应用：

7、(1)制备检测家蚕微孢子虫的产品；

8、(2)制备诊断家蚕微粒子病的产品。

9、本发明的第三方面，提供一种检测家蚕微孢子虫的比色检测体系，包括：胶体金溶液和上述的核酸适配体。

10、本发明的第四方面，提供一种基于核酸适配体-胶体金比色检测家蚕微孢子虫的方法，包括以下步骤：

11、将制备好的胶体金溶液ph调为8.0后，和上述核酸适配体的溶液混匀，室温静置10-30min，分别加入系列浓度的家蚕微孢子虫悬液，混匀，室温静置20-40min，再加入氯化钠溶液，室温静置2-3min，在400-800nm下进行扫描，建立家蚕微孢子虫浓度的对数值与a650/a520比值之间的线性回归方程，利用线性回归方程对样品中家蚕微孢子虫进行计算。

12、优选的，所述胶体金溶液、核酸适配体溶液和氯化钠溶液加入的体积比为100:40:20。

13、优选的，所述核酸适配体溶液中的核酸适配体浓度为600nmol/l。

14、优选的，所建立的线性回归方程为y＝0.1337lgc+0.2459，相关系数r2＝0.94。

15、本发明的有益效果：

16、(1)本发明首次筛选出了一种特异性结合家蚕微孢子虫的核酸适配体，其特异性强、亲和力高，可以大量快速地在体外合成，制备方法简单，容易获取；与抗体相比，具有分子小、合成容易、可进行修饰、不易降解等优点。

17、(2)基于本发明的核酸适配体，本发明建立的一种基于核酸适配体的胶体金比色法，可用于蚕业生产中家蚕微孢子虫的检测，有效解决了传统镜检方法灵敏度不高、血清学检测抗体制备繁琐、pcr技术操作复杂等问题，本发明的检测方法不仅灵敏度高、特异性好，而且操作简单、成本低，可以快速准确的检测出家蚕微孢子虫。

技术特征：

1.一种特异性识别家蚕微孢子虫的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体具有如下(1)或(2)所示的序列：

2.权利要求1所述的核酸适配体在如下(1)或(2)中的应用：

3.一种检测家蚕微孢子虫的比色检测体系，其特征在于，包括：胶体金溶液和权利要求1所述的核酸适配体。

4.一种基于核酸适配体-胶体金比色检测家蚕微孢子虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述胶体金溶液、核酸适配体溶液和氯化钠溶液加入的体积比为100:40:20。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述核酸适配体溶液中的核酸适配体浓度为600nmol/l。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所建立的线性回归方程为y＝0.1337lgc+0.2459，相关系数r2＝0.94。

技术总结本发明公开了一种特异性识别家蚕微孢子虫的核酸适配体及其应用，属于家蚕病害检测技术领域。本发明首次筛选出了一种特异性结合家蚕微孢子虫的核酸适配体，其特异性强、亲和力高，可以大量快速地在体外合成，制备方法简单，容易获取；与抗体相比，具有分子小、合成容易、可进行修饰、不易降解等优点。基于本发明的核酸适配体，本发明建立的一种基于核酸适配体的胶体金比色法，可用于蚕业生产中家蚕微孢子虫的检测，有效解决了传统镜检方法灵敏度不高、血清学检测抗体制备繁琐、PCR技术操作复杂等问题，本发明的检测方法不仅灵敏度高、特异性好，而且操作简单、成本低，可以快速准确的检测出家蚕微孢子虫。技术研发人员：高绘菊,宫衲,孙晓梅,罗宁受保护的技术使用者：山东农业大学技术研发日：技术公布日：2024/12/2