一种基于dI修饰引物的单链DNA合成技术的制作方法

本发明涉及核酸制备与检测，尤其涉及一种基于di修饰引物的单链dna合成技术。

背景技术：

1、核酸制备是核酸测序与检测的基础。分子诊断又称为基因检测或核酸检测，作为体外诊断的三大技术之一，发展最为迅速，准确度最高，在疾病诊断中越来越重要，具有巨大的市场容量。核酸检测技术不仅在传染病检测和基因突变检测、小核酸检测等临床诊断上具有广泛应用，另外在畜牧养殖病害检测、科研等领域也具有广泛的应用。聚合酶链式反应(pcr)是众多核酸制备和检测的技术基础。基于pcr技术开发的荧光定量pcr(qpcr)技术广泛用于传染病、性病、肿瘤、遗传病、snp的筛查检测。近年开发了多种等温核酸扩增技术，包括环介导等温扩增技术(lamp)、重组聚合酶扩增(rpa)、解螺旋酶依赖扩增(hda)等，这些技术不需要昂贵的pcr，操作简单、扩增通量大，目标核酸扩增产量高。

2、di碱基是一种稀有的天然碱基，可以与四种正常碱基atcg配对，优先与c配对。bstdna聚合酶、taq dna聚合酶、tth dna聚合酶等a家族dna聚合酶能够以含有di碱基的dna模板合成互补链，因此可以利用di修饰引物，pcr合成双链dna产物。内切核酸酶v是一种dna核酸内切酶，专一性水解di碱基3’端的磷酸二酯键，形成dna链切口，该切口可以作为dna重新合成的引发点，起到引物的功能，由bst dna聚合酶等强链置换活性的dna聚合酶进行dna持续合成。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于di修饰引物的单链dna合成技术，通过利用一条di修饰引物与一条普通引物经pcr扩增靶核酸双链dna；然后采用耐热内切核酸酶v在di碱基3’端切断dna链，重复进行引物再生，利用bst dna聚合酶大片段催化链置换合成，置换出单链dna；不依赖于pcr仪，通过恒温反应制备大量目标单链dna，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于di修饰引物的单链dna合成技术，包括以下工作步骤，能够持续合成单链dna：

3、s1、利用一条带有一个di碱基的pcr引物和一条普通引物，进行pcr扩增，合成一条链带有di碱基的双链dna,完成pcr扩增反应体系的建立。

4、s2、将步骤一的pcr产物进行纯化，去除pcr反应中的残留多余引物，为后续的单链dna合成提供高质量的双链dna底物。

5、s3、进行目标单链dna的持续合成反应，在反应体系中加入步骤二制备的pcr产物、热稳定性内切核酸酶v、bst dna聚合酶大片段或具有链置换合成活性的其它dna聚合酶、dntp，合成目标单链dna。

6、优选的，所述s1中的di修饰引物含有一个次黄嘌呤碱基di，所述di碱基距离5’端≥15个碱基。

7、优选的，所述di碱基距离3’端无要求。

8、优选的，所述s3中的目标单链dna合成反应于65度中保温一定时间，所述保温时间为15分钟-过夜。

9、优选的，所述目标单链dna通过在保温过程中利用热稳定性内切核酸酶v实现引物的酶促持续再生，并由bst dna聚合酶大片段持续不断进行链置换合成。

10、本发明的有益效果是：

11、本发明直接合成单链dna，不需要后续酶法消化或碱变性等处理，同时产量高，单链合成产量高达100倍，并且模板链可以重复利用，重复进行dna单链的合成，最后合成的单链dna的5’端为磷酸基团，可以直接作为dna连接反应的底物。

技术特征：

1.一种基于di修饰引物的单链dna合成技术，其特征在于，包括以下能够持续合成单链dna的工作步骤：

2.根据权利要求1所述的一种基于di修饰引物的单链dna合成技术，其特征在于，所述s1中的di修饰引物含有一个次黄嘌呤碱基di，所述di碱基距离5’端≥15个碱基。

3.根据权利要求2所述的一种基于di修饰引物的单链dna合成技术，其特征在于，所述di碱基距离3’端无要求。

4.根据权利要求1所述的一种基于di修饰引物的单链dna合成技术，其特征在于，所述s3中的目标单链dna合成反应于65度保温一定时间，所述保温时间为15分钟-过夜。

5.根据权利要求4所述的一种基于di修饰引物的单链dna合成技术，其特征在于，所述目标单链dna通过在保温过程中利用热稳定性内切核酸酶v实现引物的酶促再生，并由bstdna聚合酶大片段持续不断进行合成。

6.根据权利要求1所述的一种基于di修饰引物的单链dna合成技术，其特征在于，所述s3中的目标单链dna的持续合成反应还可以通过加入步骤二制备的pcr产物、热稳定性内切核酸酶v以及具有链置换合成活性的dna聚合酶和dntp，来合成目标单链dna。

技术总结本发明涉及一种基于dI修饰引物的单链DNA合成技术，包括：S1、利用一条带有一个dI碱基的PCR引物和一条普通引物，PCR扩增合成一条链带有dI碱基的双链DNA；S2、将步骤一的PCR产物进行纯化，去除PCR残留多余引物，为单链DNA合成提供高质量的双链DNA底物；S3、进行目标单链DNA的持续合成反应，在反应体系中加入步骤二制备的PCR产物、热稳定性内切核酸酶V、Bst DNA聚合酶大片段、dNTP，合成目标单链DNA。本发明直接酶法合成单链DNA，单链合成产量为模板量的几百倍，模板链可以重复进行DNA单链的合成，合成的单链DNA的5’端为磷酸基团，可以直接作为DNA连接反应的底物。技术研发人员：张立奎受保护的技术使用者：苏州秀博基科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/12/2