缺失型转录元件及其在家蚕分子育种中的应用

本发明属于分子育种，涉及一种家蚕抗拟除虫菊酯类杀虫剂的分子标记，具体为缺失型转录元件及其在家蚕分子育种中的应用。

背景技术：

1、家蚕(bombyx mori)作为重要的经济昆虫，经过几千年的驯化选育，对农药等不良环境高度敏感，易发生急性或慢性中毒，从而影响蚕茧产量，损害蚕农利益。当前，桑园通常与谷物、蔬菜和水果等经济作物相邻，农药高空喷施造成农药沉积分布和残留时间不一，导致生态系统中农药微量残留现象普遍存在。而微量农药的污染，易造成家蚕在上簇过程中不结茧、结薄皮茧等现象，给养蚕业带来巨大损失，并对蚕农养蚕信心造成负面影响。因此，家蚕微量农药中毒成为制约蚕桑产业安全生产的关键因素，多项研究证实，拟除虫菊酯类杀虫剂是导致桑园农药污染的主要因素。本课题组在前期的家蚕耐农药品种选育研究中，筛选出对拟除虫菊酯类杀虫剂具有高耐受性的家蚕品系“f7”，尤其是食下胃毒的抗性指标更为显著。家蚕品系f7对菊酯农药的耐受能力高于常规品种大造100-120倍，是研究家蚕对菊酯类农药的抗性机制与培育耐农药家蚕品种的良好素材。

2、细胞色素p450基因广泛存在于动物、植物、真菌和细菌等生物中，其参与生物体中许多重要的生命过程，是自然界中最具功能多样性的生物催化剂。它对异生物质的代谢特性导致了昆虫对杀虫剂的抗药性和对植物有毒物质的耐受性。细胞色素p450s的研究促进鳞翅目害虫的生物防治技术发展。现有技术中，如王燕红等(2009)对野桑蚕进行溴氰菊酯诱导、赵华强等(2010)利用氯氰菊酯诱导野桑蚕，细胞色素p450基因均表现出上调表达。另外，中国专利202311098754.0公开了一种二斑叶螨细胞色素p450基因在降解农药中的应用，该现有技术发现一个细胞色素p450基因在二斑叶螨种群中呈现过量表达，通过异源表达后可体外代谢阿维菌素。

3、然而，在生产实践中，细胞色素p450基因的表达水平并不高，本课题组在前期试验过程中，向多个品种的家蚕幼虫中添食0.1mg/l溴氰菊酯的桑叶，24h后的存活率仅为5％左右。且本课题组也通过试验证实，家蚕细胞色素p450基因(bmcyp4c1)为显性基因。因此，基于以上因素考量，如何提高家蚕细胞色素p450基因(bmcyp4c1)的表达水平是现有技术中丞待解决的难题。

技术实现思路

1、解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，提高细胞色素p450基因(bmcyp4c1)的表达水平，从而更好的发挥基因的功能，以实现家蚕对拟除虫菊酯类杀虫剂的高耐受性；鉴于此，本发明提供了缺失型转录元件及其在家蚕分子育种中的应用。

2、技术方案：缺失型转录元件，其具有：

3、(1)、如seq id no:1所示的核苷酸序列；或

4、(2)、与(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸而获得的序列；或

5、(3)、与(1)或(2)所述的核苷酸序列具有至少85％序列同源性的核苷酸序列。

6、其中，seq id no:1序列如下：

7、ttaacagtttcacaggcgatgtacaggcctttagtcttaacagtaagcctctgatacgc

8、ccttttcggttgccacttggaggttgcatcgccgactcttagggcccgcgttcagtcag

9、cgggtgctcaatggtttcatcagtgctttcaactgcaagtcgagggcgctcgtcaccca

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19、atatttaaaaaaatgaatacctcaccaattcgtaaaaataaaagtggttcgtaattca

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22、gaagaaatgccgcgaaccacgtcttgcaagaagaaaataccatgtggtgtttagatga

23、tgtcatggaactcgctagtcggcatcgatgcgccatttcgacaaagcggcacgacacg

24、agagccctctcatcgtggccgtcggtaactacattcccgatcctacggacagaatgga

25、aagcagtcgatgtcgcccaaaacacgtcatttcggatcctcccgatccaataacgggg

26、cttttaggtacctcaagcaccggttaccgttctcgtcgaacccgtcgcttgcgacgaag

27、ggctcgacgagtaaattaaccctcagacacagcccactgcgtttctcgccggatcttct

28、cagtgggtcgcgttgccggtccagtggtagattctgcgaagcactgctcttgctagggt

29、tcgtgttagcaacgtcatcaggtttgagccccgcgagctcacctactagttaaggttcc

30、gctggtatagcctctcaaggctatcagcttaggtaggaaaaaaagaaaaaactctgtg

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32、tttaagaatataattagtttcaatgttcacaccactgtgaaaacacctttacccttcag

33、ttgc。

34、以上所述的缺失型转录元件在作为家蚕细胞色素p450基因(bmcyp4c1)表达启动子中的应用；其中，家蚕细胞色素p450基因(bmcyp4c1)的全长cds序列如seq id no:2所示：

35、atgagtaattttacagagacagctttggggatcaagatggaggatcacagtgcggtca

36、accagcagtacgagcaggctcttcacgacatcttcgcggttctcaccgagagattcca

37、aaagttctggctgcactacgacttcgtatataacagaactaaactcaaggaacgagag

38、gatcagatcattaaagtcttgcataacatgtctaatacggctctgcaacaaagaaaat

39、ctgttttcttgcaagaacacgacacggcctccgacaagccgacagataaatcgaagac

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41、gaggaggtggacaacatcatattcgctggacacgacaccatctcgacggtgctgacga

42、ctgcgctgtcgttgttgggctcgcacccagacgttcaggataaagtctacaacgaagt

43、gcggcgcgtgctgggcgacgcggagcgtgacgtcaccaaggaggactacctgcggct

44、ggagtacctggaggccgtgctgaaggagtccatgaggatgtaccccgtggcgcccgtc

45、atcgcgaggtactccgacgcagaagtgaagctgaaaaactacacagccccagccggt

46、agtgggttcatactactgttgtggggggtccaccagcaccgtatctggggagcagacg

47、cagaccagttcaggcctgagcgatggctggaagcggccacgctaccagatccttcgtt

48、cttcgccggctttagcaccggcaggaggagctgcatcggtaaagtgtacgcaatgatg

49、tcgatgaagaccactctatcgttcctactgaggcgataccgcgtcagctctgacgtcac

50、cgacttggagttcaagcttgaggccatactgaggccgcacagaggacactatatagctatcgagaggagaagcaaagacgataaataa。

51、以上所述的缺失型转录元件在诱导家蚕细胞色素p450基因(bmcyp4c1)显著上调表达中的应用。

52、以上所述的缺失型转录元件在作为家蚕抗拟除虫菊酯类杀虫剂的分子标记中的应用。

53、以上所述的缺失型转录元件在作为家蚕抗拟除虫菊酯类杀虫剂分子育种靶标中的应用。

54、优选的，克隆所述缺失型转录元件的特异性引物序列为：正向引物seq id no:3，5'-ttaacagtttcacaggcgat-3'；反向引物seq id no:4，5'-gcaactgaagggtaaaggtg-3'。

55、包含以上所述缺失型转录元件的表达载体。

56、包含以上所述表达载体的宿主细胞。

57、以上所述的表达载体或所述的宿主细胞在作为家蚕细胞色素p450基因(bmcyp4c1)表达启动子中的应用。

58、以上所述的表达载体或所述的宿主细胞在诱导家蚕细胞色素p450基因(bmcyp4c1)显著上调表达中的应用。

59、有益效果：(1)本发明所述缺失型转录元件作为启动子时，能够显著提高家蚕细胞色素p450基因(bmcyp4c1)的表达水平，因此，所述缺失型转录元件能够作为家蚕抗拟除虫菊酯类杀虫剂的分子标记、或作为分子育种的靶标；(2)包含所述缺失型转录元件的表达载体、宿主细胞、甚至杂合体同样具备家蚕细胞色素p450基因(bmcyp4c1)的高表达水平；(3)所述缺失型转录元件从新的角度为家蚕细胞色素p450基因(bmcyp4c1)在农业生产中害虫的生物防治提供指导。