一种伪狂犬病病毒三基因缺失株及应用

本发明属于动物病毒学及基因工程学，具体涉及一种伪狂犬病病毒流行株gg/gi/ge/三基因缺失株的构建与应用。

背景技术：

0、技术背景

1、猪伪狂犬病(pseudorabies，pr)是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，prv)引起的养猪业的一种严重经济性传染病。该病在我国的流行主要经历了两个阶段，第一次大规模流行发生于1970s，经典毒株引起仔猪高死亡率与种猪繁殖障碍，疫苗配备相应诊断制剂的使用防控住了该病的流行。后续2011年前后，prv变异毒株出现，与经典毒株相比表现出更大的毒力，经典毒株制备的疫苗不能有效防控。本技术人所在的动物科技学院，动物医学院和湖北省生猪健康养殖协同创新中心课题组2021年从河南省某地分离到一株prv变异强毒株hen21，能够引起更大日龄的肥猪严重呼吸道感染并死亡。本发明以hen21株为亲本，对其进行了gg/gi/ge基因的缺失，制备不同剂型基因缺失灭活疫苗，探究这两种疫苗不同免疫途径对小鼠与仔猪的安全性与免疫效力，为伪狂犬病毒变异株疫苗提供技术储备。

2、本技术人所在的生猪健康养殖协同创新中心的课题组一直从事国内prv流行病学调查与机制研究工作，本发明从实验室近年来分离的prv毒株中筛选出prv hen21株，研究表明其与伪狂犬病病毒变异株的亲缘关系较近，对小鼠和猪的致病力明显高于经典毒株，是能开发有效防控当前伪狂犬病流行的基因缺失疫苗的理想候选毒株。

技术实现思路

1、本发明第一个目的在于构建一株伪狂犬病病毒流行株gg/gi/ge三基因缺失株，制备不同剂型、不同免疫途径基因缺失灭活疫苗。来克服现有猪伪狂犬病疫苗针对当前伪狂犬病病毒变异株保护力不足的缺点。

2、本发明第二个目的在于提供一种构建该伪狂犬病病毒流行株gg/gi/ge三基因缺失株的方法。

3、本发明第三个目的是提供该伪狂犬病病毒流行株gg/gi/ge三基因缺失灭活疫苗的临床应用效果。

4、本发明通过下述技术方案实现：

5、本发明在对伪狂犬病病毒流行病学调查时从疑似猪伪狂犬病病料中通过微生物学分离方法得到一株伪狂犬病病毒prv hen21，pseudorabies virus prv hen21，于2024年6月11日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno：v202424。对该伪狂犬病病毒的gb、gc和ge序列测定发现其与当前流行的伪狂犬病病毒变异株亲缘关系较近。动物回归实验显示，该毒株毒力较强，免疫原性良好，适合作为疫苗研究的候选毒株。

6、本发明构建的伪狂犬病病毒流行株gg/gi/ge三基因缺失株，是将该毒株基因组中的、gg、gi/ge(俗称糖蛋白)的部分基因被敲除后得到的。具体敲除的基因片段如下所述:

7、本发明缺失株中gg基因缺失部分核苷酸序列如下所述(该序列同序列表seq idno:1所示的序列)：

8、ctgcagcccgggctgtacgacgccggcctgtacatcgtcgtgctcgtctttggcgacgacgcctacctcggcaccgtctccctgtcggtggaggccaacctggactacccctgcggcatgaagcacgggctcacgatcacccgccccggggccaccctcccgcccatcgcccccacggccggcgaccaccagcgctggcgcgggtgcttcccctcgaccgacgagggcgcctgggagaacgtgaccgccgccgagaagggcctgtccgacgactacgccgactactacgacgtgcacatcttccgcctggagtctgacgacgaggtcgtccacggcgatgcccccgaggcccccgagggcgaggaggtgaccgaggaggaggccgagctgacctccagcgacctcgacaacatcgagatcgaggtcgtgggctcgcccgccgctcccgtcgagggcgccggcgacggcgaggaggggcacggggacgaggaggacgaggagctgacctccagcgacctcgacaacatcgagatcgaggtcgtgggctcgcccgcggccgcccgcttcttcgccgcctccaccaccccccgcgcccccacccgcgcggccgagatcacgaccatgaccacggtcaccaccgtgcggacgaccgaggaccccagcggcatcaccgactgccgccggagcgacttcgtctcgccctctgacatcttcgtgacccccaccggcagccccgccctgctcctgggcttcctgggcagcgcgctcgcctcgcgccccctgcacctgacggccggggagacggcccagcacgtgcgcgaggcccagcagaagagccgccacgtccgctccctcggcggcctccagctctcggtcgagaccgagaccaccaacaccaccaccacccagacgggcctgtcgggcgacatccgcacctcgatctacatctgcgtcgccctcgccggcctggtcgtcgtgggcatcgtcatcatgtgcctccacatggcgatcatcagggcccgggcccggaacgacggctaccgccacgtggcctccgcctgacccggccccgcccgactcccccgcgattcccc；

9、本发明缺失株中gi/ge基因缺失了部分核苷酸序列如下所述(该序列同序列表seqid no:2所示序列)：

10、cgccgagggggcgccccgtccccacgtcgccgcccgcggacgagtgccggcccgtcgtcggatcgtggcacgacagcctgcgcgtcgtggaccccgccgaggacgccgtgttcaccacccagcccccgcccgagcccgagccgccgacgacccccgcgcccccccgggggaccggcgccacccccgagccccgatcggacgaggaggaggagggtgacgcggagacgacgacgccgacgctgaccccggcgcccgggaccctggacgcgaacggcacgatggtgctgaacgccagcgtcgtgtcgcgcgtcctgctcgccgccgccaacgccacggcgggcgcccggagccccgggaagatagccatggtgctggggcccacgatcgtcgtcctcctgatcttcctgggcgggatcgcctgcgtggcccggcgctgcgcgcggaatcgcatctaccggccgcgacccgggcgcggatcggcggtccatgcggcgcccccgcggcgcccgccccccaaccccgtcgccggggcgcccgtcccccagcccaagatgacgttggccgagctgcgccagaagctcgccaccatcgcagaagaacaataaaaaggtggtgtttgcataattttgtgggtggcgttttatctccgtccgcgccgttttaaacctgggcacccccgcgagtctcgcacacaccggggttgagaccatgcggccctttctgctgcgcgccgcgcagctcctggcgctgctggccctggcgctctccaccgaggccccgagcctctccgccgagacgaccccgggccccgtcaccgaggtcccgagtccctcggccgaggtctgggacgacctctccaccgaggccgacgacgatgacctcaacggcgacctcgacggcgacgaccgccgcgcgggcttcggctcggccctcgcatccctgagggaggcgcccccggcccatctggtgaacgtgtccgagggcgccaacttcaccctcgacgcgcgcggcgacggcgccgtgctggccgggatctggacgttcctgcccgtccgcggctgcgacgccgtgtcggtgaccacggtgtgcttcgagaccgcgtgccacccggacctggtgctgggccgcgcctgcgtccccgaggccccggagatgggcatcggcgactacctgccgcccgaggtgccgcggctccggcgcgagccgcccatcgtcaccccggagcggtggtcgccgcacctgagcgtcctgcgggccacgcccaacgacacgggcctctacacgctgcacgacgcctcggggccgcgggccgtgttctttgtggcggtgggcgaccggccgcccgcgccggcggacccggtgggccccgcgcgccacgagccccgcttccacgcgctcggcttccactcgcagctcttctcgcccggggacacgttcgacctgatgccgcgcgtggtctcggacatgggcgactcgcgcgagaactttaccgccacgctggactggtactacgcgcgcgcgcccccgcggtgcctgctgtactacgtgtacgagccctgcatctaccacccgcgcgcgcccgagtgcctgcgcccggtggacccggcgtgcagcttcacctcgccggcgcgcgcgcggctggtggcgcgccgcgcgtacgcctcgtgcagcccgctgctcggggaccggtggctgaccgcctgccccttcgacgccttcggcgaggaggtgcacacgaacgccaccgcggacgagtcggggctgtacgtgctcgtgatgacccacaacggccacgtcgccacctgggactacacgctcgtcgccaccgcggccgagtacgtcacggtcatcaaggagctgacggccccggcccgggccccgggcaccccgtggggccccggcggcggcgacgacgcgatctacgtggacggcgtcacgacgccggcgccgcccgcgcgcccgtggaacccgtacggccggacgacgcccgggcggctgtttgtgctggcgctgggctccttcgtgatgacgtgcgtcgtcggggggg；

11、申请人将构建的伪狂犬病病毒流行株gg/gi/ge三基因缺失株命名为伪狂犬病病毒hen21-δgg/gi/ge，pseudorabies virus hen21-δgg/gi/ge，于2024年6月11日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no：v202464。

12、伪狂犬病病毒流行株gg/gi/ge三基因缺失株的微生物学形态和生理学特征如下(即称微生物菌学特征)：

13、将hen21-δgg/gi/ge毒株在pk-15细胞中连续传代20次，每5代进行一次pcr鉴定、片段测序与毒价测定。结果表明gg/gi/ge部位稳定缺失，并未发生碱基突变与插入，细胞连续传代过程中hen21-δgg/gi/ge的毒价也保持在一个相对稳定的范围(108.0～108.59tcid50)内。间接免疫荧光试验结果显示，hen21-δgg/gi/ge在荧光用显微镜下并未发出ge特异性荧光，能够实现与野毒的血清学鉴别诊断。将hen21-δgg/gi/ge毒株以1moi的剂量感染pk-15细胞，不同时间段收毒测定病毒滴度，结果表明hen21-δgg/gi/ge毒株增殖特性与亲本毒株相近。用1moi剂量的hen21-δgg/gi/ge感染pk-15细胞测定空斑形成能力，结果显示，hen21-δgg/gi/ge的平均空斑面积为25842.1μm2，其亲本毒的平均空斑面积为31504.9μm2，两者相比前者的噬斑能力有一定程度的下降。采用102-104tcid50剂量hen21-δgg/gi/ge攻毒小鼠，其ld50结果显示，hen21-δgg/gi/ge为102.87tcid50，与亲本毒的102.63tcid50相比，毒性降低不明显，说明不进行tk基因缺失的prv毒株毒力仍然较强。针对该hen21-δgg/gi/ge毒株一系列生物学特性结果，选择制备hen21-δgg/gi/ge的灭活疫苗。

14、伪狂犬病病毒流行株gg/gi/ge三基因缺失灭活疫苗的动物试验：

15、将25只4-6周龄健康balb/c小鼠随机分为5组，分别皮下免疫灭活hen21-δgg/gi/ge、barthak-61与商品化prv变异毒株疫苗以107tcid50的剂量，同时设置阴阳性对照，连续观察14d，记录存活情况。将9只4-6周龄伪狂犬gb、ge阴性仔猪平均分为3组。第一组肌注2×108.0tcid50剂量的hen21-δgg/gi/ge灭活苗；第2组无针注射hen21-δgg/gi/ge灭活冻干苗2×108.0tcid50，第3组接种dmem作为未感染对照组。接种后每日观察症状，记录死亡数和存活数，观察14d。试验结果表明，高剂量的hen21-δgg/gi/ge基因缺失灭活苗对小鼠和仔猪都是安全的，能够用于进一步的临床实践。

16、小鼠免疫原性试验中，将20只4-6周龄健康spf级balb/c小鼠平均分为四组，每组5只。分别皮下免疫1×107tcid50剂量的hen21-δgg/gi/ge基因缺失灭活苗、barthak-61灭活苗，并设置商品化prv变异毒株灭活苗为对照，最后一组作为空白对照。一免后14d进行加强免疫，28d攻毒致死剂量的hen21，之后连续观察14d，期间每7d采集一次血清，检测小鼠体内gb、ge、中和抗体水平。试验结果表明，ge抗体水平在攻毒后14天内一直保持阴性，说明高剂量的灭活疫苗能够在攻毒2周内完全阻断伪狂犬病病毒的野毒感染；gb抗体水平在一免后14天开始转阳，并持续到观察期最后一天；三个免疫组在免疫期间中和抗体水平呈持续上升状态，并在免疫42天时分别产生1：178，1：130，1：162的中和抗体，病理切片结果显示，三个免疫组都无明显病变产生，攻毒对照组则出现伪狂犬病毒感染典型病理变化。

17、仔猪免疫原性试验中，将25头4-6周龄健康prv阴性仔猪平均分为5组，第一组无针注射hen21-δgg/gi/ge灭活冻干苗2×108tcid50,第二组肌注免疫hen21-δgg/gi/ge灭活苗2×108tcid50,第三组肌注免疫商品化prv变异毒株灭活苗2×108tcid50,并设置攻毒对照与空白对照。一免后21d进行加强免疫，加免后14d滴鼻感染hen21毒株2×107tcid50/头，分别在免前、免后21d、35d，攻毒后每3-4d采集一次血液，监测血清抗体水平。根据时间段采集抗凝血、咽拭子与肛拭子，进行称重、测温、临床症状打分。gb elisa抗体结果表明，三组疫苗试验猪在免后第21d均表现出较强的gb阳性，攻毒第2周gb阳性值到达最高水平，持续到试验观察最后一天，仍保持较强阳性值。ge elisa试验结果表明，商品化疫苗免疫组在攻毒后一周ge抗体即开始转阳，而hen21-δgg/gi/ge肌注组在攻毒后第3周才开始转阳，hen21-δgg/gi/ge无针组则始终保持着ge阴性，仅在观察期最后一天检测到微弱的ge抗体的存在。从中和抗体水平、攻毒后体温变化曲线、试验期平均增重水平、组织病毒载量结果来看，hen21-δgg/gi/ge无针组表现最为优秀，攻毒一周内未出现任何发热情况；21天内平均增重最多；中和抗体水平比其他免疫组提前一周达到1：256；三组均能有效抵抗prv强毒株的攻击，提供60％的临床保护率。综上所述，将最新的伪狂犬变异毒株基因缺失后，灭活冻干进行无针皮内免疫或许可以作为一种新的免疫方式应用于猪场。