一种利用重组流感病毒免疫小鼠制备杂交瘤单抗的方法及应用与流程

本申请属于生物，具体地，本申请提供了一种利用重组流感病毒免疫小鼠制备杂交瘤单抗的方法及其应用。

背景技术：

1、流感病毒广泛流行于禽类，哺乳动物及人。宿主分布广，变异快，常给人类和动物养殖如禽类和猪带来较大疾病负担。从病毒分类学讲，流感病毒属于有囊膜的rna病毒，其rna为负股。流感病毒粒子内部其内核为包裹了单链rna的核糖体核蛋白，内部外核包裹着基质蛋白m1。流感病毒基因组由八个分节段的线性基因片段构成（c型流感病毒只有七个基因片段），八个基因片共段编码十个蛋白，分别为：rna依赖性rna聚合酶（pb2，pb1，pa），形成核衣壳的核蛋白np，基质膜蛋白（m1, m2），两个表面膜蛋白（血凝素ha和神经氨酸酶na），非结构蛋白ns1和核出运蛋白nep。病毒基因的转录和复制发生于宿主细胞核内，病毒组装和出芽形成于宿主细胞膜。两个不同流感病毒同时感染一个细胞时会发生基因重配。流感病毒的八个基因片段共编码九个结构蛋白（pb2, pb1, pa, ha, np, na, m1, m2, nep），一个非结构蛋白ns1。

2、流感病毒在遗传进化过程中产生很多天然基因缺失或插入，但主要以缺失最为普遍 。这些缺失或插入对病毒的致病性，宿主范围扩大，新宿主适应都有重要作用。基因缺失主要集中在na基因和ns1基因，尤其是动物源性流感病毒在感染和适应新宿主的过程中会经常出现，且缺失的具体位置和数目在不同毒株之间会有所差异。插入主要出现在低致病性流感病毒变为高致病性流感病毒时，在ha基因的切割位点/glf基序前插入多个碱性氨基酸，如krrk等。此类ha蛋白多个碱性氨基酸的插入只出现在h5和h7亚型流感病毒中。流感病毒这些缺失和插入表明病毒的基因组在这些位置可以容忍变异，因此人们尝试通过缺失的位置改造流感病毒，如ns1基因缺失病毒等。

3、与此同时，研究表明ns1缺失区域可以加入外源基因，如人白介素15（il15）基因，此类重组病毒可以表达目的蛋白il15，以此将流感病毒作为外源基因的表达系统，在体内免疫调节中发挥一定作用。利用na的缺失在na基因上加入gfp蛋白基因，使重组流感病毒在复制的过程中可表达gfp，且重组病毒拥有和野生病毒较为相似的生物学特性，以此让病毒在体内感染时达到可视化的效果。改造后的流感病毒带有的外源基因多用来作为更为敏感的报告病毒，以此筛选抗病毒药物或致病机理研究。

4、杂交瘤单克隆抗体技术是应用适当的抗原免疫小鼠，然后取免疫鼠(peg) 与鼠的脾细胞(抗体形成细胞) 或取体外免疫的脾细胞，借助聚乙二醇骨髓瘤细胞系融合形成分泌单克隆抗体的杂交瘤。该方法目前是单抗制备筛选的主流技术，其中抗原的选择和应用时单抗制备质量和成功率的重要因素。

技术实现思路

1、本发明利用a型流感病毒聚合酶基因pa的5‘和3’端病毒颗粒包装信号序列，将编码目标蛋白的基因片段（流感病毒h7n9亚型血凝素ha，带状疱疹病毒表面糖蛋白ge，诺如病毒核衣壳蛋白vp1）通过基因工程的方法克隆到流感病毒pa基因3’末端，通过反向遗传技术拯救并包装出具有感染和复制活性的重组流感病毒作为免疫原，重组病毒分别命名为fluvec-h7， fluvec-ge，fluvec-nov/vp1。用以上重组病毒经滴鼻感染途径免疫小鼠后2周采集小鼠脾脏细胞与sp20融合，筛选分泌针对目标蛋白的单克隆杂交瘤细胞株。以上免疫筛选鼠单抗的方法与传统用蛋白抗原免疫小鼠筛选杂交瘤的方法相比，本发明筛选出的单克隆抗体数量多，质量高，整个流程所需时间大幅缩短。具有很高的应用前景。

2、一方面，本申请提供了一种利用重组流感病毒免疫小鼠制备杂交瘤单抗的方法，所述方法中使用的重组流感病毒pa-抗原融合基因，所述pa-抗原融合基因自5’段起依次包括pa基因、密码子转换信号肽序列、2a序列、il-2信号肽序列、抗原基因序列以及cd80的c末端序列。

3、进一步地，所述抗原为流感病毒h7n9亚型血凝素ha、带状疱疹病毒表面糖蛋白ge或者诺如病毒核衣壳蛋白vp1。

4、进一步地，所述pa基因的序列如seq id no.13所示。

5、进一步地，所述密码子转换信号肽序列的序列如seq id no.14所示。

6、进一步地，所述2a序列的序列如seq id no.15所示。

7、进一步地，所述il-2信号肽序列的序列如seq id no.16所示。

8、进一步地，所述cd80的c末端序列的序列如seq id no.17所示。

9、进一步地，所述抗原基因序列选自seq id no.9-12中任一个。

10、进一步地，所述重组流感病毒是通过反向遗传系统，拯救制备获得。

11、进一步地，所述方法包括使用重组流感病毒免疫小鼠的步骤。

12、进一步地，使用滴鼻法免疫小鼠，剂量为1×104-106pfu。

13、本申请的方法可用于抗体制备。

14、传统小鼠杂交瘤单抗技术中免疫过程需要蛋白抗原与佐剂搭配后通过肌肉或皮下注射的免疫途径，为达到针对抗原的较高免疫效价，通常需要多次加强免疫，使整个免疫过程用时通常要6周，且脾脏融合之前需要采集小鼠血清测定其抗体与目的抗原的反应效价，通常达到1：100000倍才可以进行融合以便筛选到更多的特异性单克隆抗体。本发明使用了重组流感病毒利用滴鼻感染的途径对小鼠进行免疫，感染免疫过程中流感病毒在小鼠上呼吸道的复制高效的递呈了目的抗原的同时也刺激了小鼠的免疫系统，使得分泌抗体的浆细胞快速成熟，抗体滴度在10天左右就可以检测到，因此可大大缩短制备单抗的时间。此外，通过对同一抗原不同免疫方法筛出的单抗进行深入分析发现使用本发明中描述的免疫方法获得的单抗与抗原结合区域更广泛，亲和力更高，在科研，临床以及产业应用方面有广阔空间。

技术特征：

1.一种利用重组流感病毒免疫小鼠制备杂交瘤单抗的方法，其特征在于，所述方法中使用的重组流感病毒pa-抗原融合基因，所述pa-抗原融合基因自5’段起依次包括pa基因、密码子转换信号肽序列、2a序列、il-2信号肽序列、抗原基因序列以及cd80的c末端序列。

2.根据权利要求1所述的方法，所述抗原为流感病毒h7n9亚型血凝素ha、带状疱疹病毒表面糖蛋白ge或者诺如病毒核衣壳蛋白vp1。

3.根据权利要求1所述的方法，所述pa基因的序列如seq id no.13所示。

4.根据权利要求1所述的方法，所述密码子转换信号肽序列的序列如seq id no.14所示。

5.根据权利要求1所述的方法，所述2a序列的序列如seq id no.15所示。

6.根据权利要求1所述的方法，所述il-2信号肽序列的序列如seq id no.16所示。

7.根据权利要求1所述的方法，所述cd80的c末端序列的序列如seq id no.17所示。

8.根据权利要求1所述的方法，所述抗原基因序列选自seq id no.9-12中任一个。

9.根据权利要求1所述的方法，所述重组流感病毒是通过反向遗传系统，拯救制备获得。

10.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括使用重组流感病毒免疫小鼠的步骤，其中使用滴鼻法免疫小鼠，剂量为1×104-106pfu。

技术总结本申请提供了一种利用重组流感病毒免疫小鼠制备杂交瘤单抗的方法及其应用，所述方法中使用的重组流感病毒PA‑抗原融合基因，所述PA‑抗原融合基因自5’段起依次包括PA基因、密码子转换信号肽序列、2A序列、IL‑2信号肽序列、抗原基因序列以及CD80的C末端序列。本发明使用了重组流感病毒利用滴鼻感染的途径对小鼠进行免疫，感染免疫过程中流感病毒在小鼠上呼吸道的复制高效的递呈了目的抗原的同时也刺激了小鼠的免疫系统，使得分泌抗体的浆细胞快速成熟，抗体滴度在10天左右就可以检测到，因此可大大缩短制备单抗的时间；同时本发明中描述的免疫方法获得的单抗与抗原结合区域更广泛，亲和力更高。技术研发人员：宋文俊,卢帅,李月受保护的技术使用者：北京溯本源和生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/21