一种焦磷酸盐荧光探针、制备方法及其应用

本发明涉及一种荧光探针、制备方法及其应用，更具体地说涉及一种焦磷酸盐荧光探针、制备方法及其应用。

背景技术：

1、焦磷酸盐(ppi，p2o7 4-)的检测由于其在生物学中的重要意义而得到了广泛的研究。ppi是一种常见的代谢副产物，包括dna、rna、蛋白质、肽聚糖、纤维素、淀粉和其它生物聚合物的生物合成过程中均会产生。因为ppi通过参与酶促反应，在许多生物过程中发挥着重要的作用。特别是在聚合酶反应(pcr)中，当核苷三磷酸(ntps)被并入扩增中的dna或rna时，ppi被释放，但产物ppi的堆积反而会抑制pcr过程。

2、无机焦磷酸酶(ipp)是一种自然界普遍存在的酶，参与合成糖类、核酸和蛋白质等多种代谢途径中所生成的ppi的水解，生成两分子的正磷酸盐离子(pi)。这个过程是一个高放能的过程，将多种代谢过程中产生的ppi水解，防止其过度积累，从而促进热力学平衡向生物合成方向进行。

3、到目前为止，很少有能够有效区分ppi和ntps的荧光探针被报道，尽管有许多ppi荧光探针可用，但与ppi紧密结合的探针对ppi的选择性较差(在ppi和ntps之间)。因此，为了确定pcr过程中ppi的堆积、ipp活性，反应过程中ipp的最适添加量，需要开发高灵敏度的ppi传感器来区分ppi和ntps。

4、目前对ipp活性检测的方法主要依靠对ppi水解产物pi的量来评估酶的活性，该方法的主要缺陷是分析检测较慢、操作较复杂且效率较低。因此，建立具有快速、特异和灵敏分析检测方法，具有重要意义。而荧光探针具有灵敏度高、选择性好、实时监测等优点。

5、近年来，通过荧光探针设计来筛选ppi的方法也有较多报道，但由于其对ntps仍有较强的响应导致不能有效区分ppi与ntps，以至于在pcr过程(存在大量ntps)的情况下无法选择性检测ppi，进而无法有效确定ipp酶活以及反应最适添加量。反应中添加过量的ipp将会导致成本提高。因此，开发能够快速选择性检测焦磷酸盐的荧光探针以及分析检测无机焦磷酸水解酶活性的方法是非常有必要的。

技术实现思路

1、本发明目的是克服现有技术存在的不足，提供一种焦磷酸盐荧光探针，该荧光探针与焦磷酸盐结合产生选择性荧光响应，对焦磷酸水解酶具有活性筛选。

2、本发明还提供该焦磷酸盐荧光探针的制备方法，同时还提供其在检测焦磷酸盐和筛选焦磷酸水解有效酶中的应用。

3、本发明的技术构思和原理如下：经研究发现，本发明的焦磷酸盐荧光探针可以选择性结合游离的焦磷酸盐并产生增强荧光，而腺苷三磷酸(atp)、二磷酸腺苷(adp)，单磷酸腺苷(amp)，鸟苷三磷酸(gtp)、胞苷三磷酸(ctp)、胸腺苷三磷酸(dttp)以及磷酸(pi)等的荧光响应微弱，具有较好的选择性和特异性，可用于对ppi选择性检测。

4、另外，可以通过荧光来表征焦磷酸的酶解动力学过程，实现对ipp的荧光响应分析。本发明发现了这种基于ppi水解产生游离pi，从而引起探针荧光变化的筛选焦磷酸水解有效酶的方法，该策略的底物和探针制备工艺简单，适用于规模化筛选酶。

5、本发明的技术方案如下：

6、本发明的焦磷酸荧光探针，其具有如式i所示的结构，名称为：4’-(3,5-二甲氧基苯基)-2,2’:6’,2”-三联吡啶锌(ⅱ)配体，简称：fl-tpy-zn2+

7、

8、本发明上述的焦磷酸荧光探针的制备方法，其包括以下步骤：将4’-(3,5-二甲氧基苯基)-2,2’:6’,2”-三联吡啶和硝酸锌(ⅱ)分散在有机溶剂中，蒸发浓缩后得黄色固体fl-tpy-zn2+；其中4’-(3,5-二甲氧基苯基)-2,2’:6’,2”-三联吡啶简称：fl-tpy。

9、本发明上述的焦磷酸荧光探针的制备方法，其进一步的技术方案是包括以下步骤：将4’-(3,5-二甲氧基苯基)-2,2’:6’,2”-三联吡啶分散在有机溶剂中，再加入硝酸锌(ⅱ)的有机溶剂溶液，蒸发除去有机溶剂，再用有机溶剂溶解，反复三次后得到黄色固体fl-tpy-zn2+；其中fl-tpy与硝酸锌(ⅱ)的用量摩尔配比为1：1。为了保证1个三吡啶基团与1个锌离子配位，在投料上fl-tpy与硝酸锌(ⅱ)的用量需要摩尔配比为1:1进行投料，又因为该前体与锌离子存在2：1配位的形式，重结晶可能会损失溶液中锌离子，只能在投料的时候用1:1投料，后续是直接将1:1投料的固体产物用缓冲液全部溶解，配备探针母液。

10、本发明上述的焦磷酸荧光探针的制备方法，其进一步的技术方案还可以是所述的有机溶剂为甲醇或乙醇。

11、本发明上述的焦磷酸荧光探针的制备方法，其进一步的技术方案还可以是所述的fl-tpy的制备方法包括以下步骤：将3,5-二甲氧基苯甲醛、2-乙酰基吡啶和片状koh加入到乙醇中，再加入浓氨水(市售浓氨水，浓度为25％～28％)，在室温条件下搅拌反应8h以上，将反应液减压抽滤，用水和冰乙醇洗涤，收集沉淀物，真空干燥过夜即得白色片状fl-tpy。

12、本发明上述的焦磷酸荧光探针可以在检测焦磷酸盐中进行应用。

13、本发明上述的焦磷酸荧光探针可以在筛选焦磷酸水解有效酶中进行应用。其应用包括以下步骤：将fl-tpy-zn2+和焦磷酸盐摩尔比3:1配位的饱和荧光溶液作为底物，用于筛选焦磷酸水解有效酶或焦磷酸酶水解有效酶水解的动力学过程监测；fl-tpy-zn2+与ppi选择性结合，表现出增强荧光响应，通过荧光淬灭速率筛选具有催化ppi转化为两分子磷酸盐的焦磷酸酶，其对磷酸盐无明显荧光响应，从而达到快速筛选焦磷酸水解有效酶。

14、本发明上述的焦磷酸荧光探针在筛选焦磷酸水解有效酶中的应用，其进一步的技术方案是所述的fl-tpy-zn2+与焦磷酸盐摩尔比3：1配位结合的分子结构式ii所示：

15、

16、本发明的反应过程或原理如图14所示。

17、本发明具有以下有益效果：

18、1)本发明中，fl-tpy和硝酸锌(ⅱ)1:1配位后得荧光探针fl-tpy-zn2+在hepes缓冲液(10mm，ph 7.4)中分散，被焦磷酸盐(ppi)选择性诱导探针分子聚集，形成具有荧光的纳米粒子并导致增强型荧光发射。

19、2)本发明焦磷酸盐荧光探针的荧光响应方法，本发明的荧光探针fl-tpy-zn2+与焦磷酸盐配合物对焦磷酸酶的荧光响应明显，配位结合比为3：1。

20、3)本发明的焦磷酸盐荧光探针，对焦磷酸盐的荧光响应较强，为212倍，超声10分钟后，检测限为37nm，对腺苷三磷酸(atp)、二磷酸腺苷(adp)，单磷酸腺苷(amp)，鸟苷三磷酸(gtp)、胞苷三磷酸(ctp)、胸腺苷三磷酸(dttp)以及磷酸(pi)等的荧光响应微弱，具有较好的选择性和特异性。

21、4)本发明的荧光探针fl-tpy-zn2+与焦磷酸盐3：1配合后，可用于焦磷酸酶水解焦磷酸底物的动力学监测。本发明的荧光探针fl-tpy-zn2+还可用于pcr扩增过程对焦磷酸盐选择性检测。