一种利用碳二亚胺偶联技术制备中国母乳脂肪相似的结构脂（OPL）的方法

本发明涉及一种固定r.miehei脂肪酶制备opl结构脂，具体涉及利用碳二亚胺偶联技术固定r.miehei脂肪酶制备中国母乳脂肪相似的结构脂(opl)的方法。

背景技术：

1、母乳被认为是婴儿最初几个月的理想食物。它提供了婴儿正常生长发育所需的几乎所有类型的营养。人乳脂肪(大于98％标签)占人乳总含量的3-5％，但可以提供婴儿正常生长发育所需能量的50％以上它具有独特的脂肪酸组成和分布，为婴儿提供多种健康益处，包括改善脂肪酸和矿物质吸收，减少便秘。由于人乳脂独特的脂肪酸分布所带来的好处，人们进行了大量研究，以合成与人乳脂具有相似脂肪酸组成和分布的结构化三酰基甘油，用于婴儿配方奶粉中的人乳脂替代品。众所周知，1,3-二磺酰-2-棕榈酰甘油(opo)是人类乳脂的主要成分。然而，另一种三酰甘油,1-油酸-2-棕榈酰-3-亚油酸甘油(opl)，也大量存在于人乳脂中。相比于欧洲国家人乳脂，中国母乳中含量最高的成分是opl，其次是opo。基于opl结构tag在中国人乳脂中的含量，它可能对中国婴儿的生长发育更为重要。然而，迄今为止，婴儿配方奶粉中使用的opl制备没有受到关注。，r.miehei的商业固定化脂肪酶已被广泛用于合成各种结构化脂类，即人乳脂肪替代品，包括opo和opl。

2、碳二亚胺偶联技术固定化酶，通过在载体材料表面的羧基与酶的氨基之间形成较强的酰胺键，提高了固定化酶的操作稳定性和活性。

3、最近，多壁碳纳米管被发现是酶固定化的优秀支撑材料，因为它们表现出优异的热、化学和机械稳定性。此外，它们具有生物相容性，并为酶固定化提供了很大的表面积。根据几项关于使用单壁碳纳米管和多壁碳纳米管的体外细胞毒性和体内毒理学研究，表面功能化的碳纳米管与早期的同类相比，并没有显示出任何显著的体外细胞毒性和体内毒性。在磁性氧化铁纳米颗粒上固定化酶的方法可以通过施加外部磁场在催化过程后更容易和更简单地回收/分离生物催化剂。磁性多壁碳纳米管是混合支撑材料，具有碳纳米管和磁性氧化铁纳米颗粒的特性，使其成为脂肪酶固定化的更有吸引力的载体。这些支撑材料的磁性使固定化酶的磁回收和可回收性变得方便。

4、因此，利用碳二亚胺偶联技术磁性固定化r.miehei脂肪酶可以有效解决游离酶稳定性和重复使用性差的缺陷，通过在酸解反应的过程中去除释放的棕榈酸，以减少三棕榈素的再合成，并最大限度地提高sn-2位油酸酯化的机会。

技术实现思路

1、本发明的目的在于利用碳二亚胺偶联技术磁性固定化r.miehei脂肪酶制备制备与中国母乳脂肪相似的opl结构脂。先将碳纳米管羧酸化，再制备羧酸化的磁性碳纳米管，然后利用碳二酰亚胺偶联技术在羧酸化的磁性多壁碳纳米管上固定化米黑根茎脂肪酶。

2、一种利用碳二亚胺偶联技术固定r.miehei脂肪酶制备opl结构脂的方法通过以下步骤实现：

3、步骤一：多壁碳纳米管羧酸化：将1.0g原始多壁碳纳米管悬浮在100ml浓度为2.6m硝酸溶液中，在70℃下回流24h。然后，用0.45μm聚碳酸酯膜过滤纯化的多壁碳纳米管，用纯净水洗涤数次，最后在真空(60℃过夜)下干燥。氧化过程如下:将1g纯化的多壁碳纳米管悬浮在3:1浓硫酸和硝酸(v/v)的混合物中。将混合物在40℃的超声波浴中超声处理4h，以在其表面引入羧酸官能团。超声处理后，将冷蒸馏水滴入混合物中，并用0.45μm聚碳酸酯膜过滤。最后，将羧酸化的多壁碳纳米管用蒸馏水洗涤数次，并在60℃真空干燥过夜。

4、步骤二：磁性碳纳米管的制备：将0.6g六水合硫酸铁铵溶于20ml由去离子水和水合肼以3:1(v/v)的比例制备的溶液中，加入0.25g羧酸化的多壁碳纳米管。然后将混合物冷却40min，用氨水调节ph值至11-13。通过连续搅拌24h，促进铁离子溶液在多壁碳纳米管中的吸收，然后在130℃下回流2h，在羧酸化的多壁碳纳米管内生成固体fe3o4纳米颗粒。回流后，用外置磁铁分离磁化后的羧酸化的多壁碳纳米管，用乙醇和去离子水洗涤。然后，用稀释的浓度为1.5m的盐酸溶液短暂洗涤磁化后的碳纳米管，再用去离子水多次洗涤，去除表面的fe3o4纳米颗粒。最后，将羧酸化的磁性多壁碳纳米管在60℃下真空干燥过夜。

5、步骤三：碳二酰亚胺偶联技术在羧酸化的磁性多壁碳纳米管上固定化米黑根茎脂肪酶：将0.1g羧酸化的磁性多壁碳纳米管分散在40ml浓度为50mm磷酸盐缓冲液(ph 6)上。在此混合物中加入40ml的400mm磷酸盐缓冲nhs溶液。然后，将混合物超声30min，加入40ml浓度为20mm edc(1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺)。接下来，将得到的溶液在150rpm下孵育60min进行活化。然后，使用外部磁铁分离活化的碳纳米管，并用相同的磷酸盐缓冲液彻底洗涤以去除多余的edc和nhs，然后将其转移到含有适量游离米黑根茎脂肪酶溶液(0.1-0.6ml)的磷酸盐缓冲液(0.1m,ph 5.5-ph 8.5)中。经过短暂超声处理后，将混合物在25–45℃不同温度下以200rpm的转速在水浴摇床中搅拌1.0 -6.0h。最后，固定化脂肪酶使用外磁铁从溶液中分离，用新鲜磷酸盐缓冲液洗涤数次，冻干并保存在4℃。收集米黑根茎脂肪酶-磷酸缓冲液和洗涤液，用brad-ford蛋白测定法测定未结合米黑根茎脂肪酶的量，由此计算固定化脂肪酶的量。

技术特征：

1.一种利用碳二亚胺偶联技术制备中国母乳脂肪相似的结构脂(opl)的方法，本方法通过以下步骤实现：

技术总结本发明提供一种利用碳二亚胺偶联技术制备中国母乳脂肪相似的结构脂(OPL)的方法。OPL在中国人乳脂中的含量较高，对中国婴儿的生长发育尤为重要。而且很难直接从天然脂肪资源中获得OPL。酶的可重用性是高效生产的最重要因素，将酶磁性固定化之后会增强脂肪酶的可重复使用性。碳二亚胺偶联技术固定化酶能够通过减少/消除产物抑制来产生更高的期望产物产量，这可能在婴儿配方奶粉中具有潜在的应用前景。技术研发人员：杜晶,王昕迪,韩晓雨,王伟宁,刘博宇,炼诒然,江连洲,王立琦,于殿宇受保护的技术使用者：东北农业大学技术研发日：技术公布日：2024/12/2