基于水疱性口炎病毒载体的狂犬病毒疫苗

本发明属于生物医药领域，具体涉及基于水疱性口炎病毒载体的狂犬病毒疫苗。

背景技术：

1、狂犬病（rabies）又称恐水症、疯狗病，是由狂犬病病毒（rabies virus，rabv）引起的人畜共患中枢神经系统急性传染病，一旦发病，病死率为100%，目前尚无有效的治疗药物和方法。狂犬病病毒主要存在于患病动物的唾液腺和唾液中，通过动物咬伤、抓伤皮肤或舔舐黏膜传染。为犬类等狂犬病病毒野生动物宿主接种疫苗是预防人类狂犬病最具成本效益的方法，因为这可以从源头阻断传播。另外，为野生动物接种疫苗还能减少对暴露后预防的需求。rabv属于弹状病毒科（rhabdoviridae）狂犬病毒属（lyssavirus），是一种具有包膜的单链负义rna病毒，它包含有5种结构蛋白：核蛋白（n）、磷蛋白（p）、基质蛋白（m）、包膜糖蛋白（g）和rna依赖的rna聚合酶（l）。狂犬病病毒的糖蛋白g是一种跨膜蛋白，具有三聚体结构，构成了病毒表面的棘突，它是目前发现的唯一可以刺激机体产生中和抗体的狂犬病毒抗原，也是唯一一种存在于所有新型狂犬疫苗中的成分。

2、传统的狂犬病疫苗是由减毒或灭活的狂犬病病毒组成的，从以巴斯德狂犬病疫苗为起始的神经组织疫苗到禽胚疫苗，再到细胞培养疫苗，狂犬病疫苗不断得到改进和完善，目前vero细胞系培养的狂犬病病毒疫苗已大量生产，广泛应用于人和动物狂犬病的预防和暴露后接种。传统疫苗中含有与野生毒株相同特征的抗原，可诱导机体产生针对糖蛋白g的病毒中和抗体，同时活化辅助t细胞以及细胞毒性t细胞,从而对致死性的狂犬病毒的致死性攻击具有保护作用。然而，目前所使用的传统狂犬病疫苗生产成本较高，缺乏针对野生动物的疫苗及投放方式考虑，且存在一定的生产和使用风险，并且在一些狂犬病发病率较高的国家，仍需要使用更经济的疫苗产品进行单次免疫以达到预防狂犬病的目的。因此研制更加经济、安全、有效的新型狂犬病疫苗成为越来越多研究者关注的重点。

3、在各种疫苗形式中，活病毒载体疫苗由于能引起相对最强的免疫反应和最佳的保护效果，现已成为新型疫苗研发的重点，而病毒载体的选择是疫苗成功的关键。水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，vsv）是弹状病毒科的代表模式毒种，被广泛用于研究有囊膜rna病毒入侵细胞、复制和装配等机制的研究。vsv病毒引起的水疱性口炎是接触性传染的良性疾病，主要感染啮齿类动物牛、猪和马，也能感染人类和其它动物。vsv抗体的缺乏和不具明显致病性是vsv作为疫苗和治疗性病毒载体的前提条件。vsv为单股负链不分节段rna病毒，基因组长约11kb，结构简单，从3'到5'依次转录出5条mrna，分别编码5种蛋白：核衣壳蛋白n（nucleocapsid protein）、磷蛋白p（phosphoprotein）、基质蛋白m（matrixprotein）、糖蛋白g（glycoprotein）、大聚合酶l（large protein）。g蛋白是i型整合膜蛋白，在病毒粒子表面以三聚体形式存在，行使与靶细胞受体结合及膜融合的功能。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何预防狂犬病（rabies）。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为了解决上述技术问题，本发明首先提供了重组病毒，所述重组病毒可为表达狂犬病病毒g蛋白的重组水疱性口炎病毒。

3、所述重组病毒可为在水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，vsv）的囊膜蛋白g（g蛋白）的前面（n端）插入狂犬病病毒g蛋白而得到的重组病毒。

4、进一步地，所述水疱性口炎病毒的基质蛋白m（m蛋白）可缺失第51位的氨基酸-甲硫氨酸。

5、所述狂犬病病毒g蛋白可来源于狂犬病病毒（rabies virus，rabv）pm1503毒株。

6、进一步地，所述狂犬病病毒g蛋白的氨基酸序列可如seq id no.2所示。

7、进一步地，所述重组病毒可含有编码本文中所述狂犬病病毒g蛋白的核酸分子，所述核酸分子可位于水疱性口炎病毒的m蛋白基因和g蛋白基因之间。

8、进一步地，所述核酸分子的核苷酸序列可如seq id no.1所示。

9、本发明还提供了制备本文中任一所述重组病毒的方法，所述方法可包括如下步骤：

10、a1）将编码本文中所述狂犬病病毒g蛋白的核酸分子导入到水疱性口炎病毒载体中，得到表达狂犬病病毒g蛋白的重组水疱性口炎病毒载体；

11、a2）将所述重组水疱性口炎病毒载体经病毒拯救得到所述重组病毒。

12、上述方法中，a1）中所述导入可以是将所述核酸分子导入到所述水疱性口炎病毒载体的m蛋白基因和g蛋白基因之间。

13、a2）中所述病毒拯救的方法可为：将所述重组水疱性口炎病毒载体和辅助质粒共同转染宿主细胞，经培养得到所述重组病毒；所述辅助质粒包括表达水疱性口炎病毒n蛋白的质粒、表达水疱性口炎病毒p蛋白的质粒、表达水疱性口炎病毒l蛋白的质粒、表达水疱性口炎病毒m蛋白的质粒、表达水疱性口炎病毒g蛋白的质粒和表达t7 rna聚合酶的质粒。

14、上述方法中，所述宿主细胞可为包装细胞。所述包装细胞用于包装缺乏编码病毒包装所需蛋白质的至少一种基因的病毒载体质粒，其可为病毒包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，且其本身不能产生任何形式的病毒颗粒。提供病毒包装所缺乏的蛋白质或多肽的任何细胞都可被考虑用作包装细胞。合适的包装细胞是本领域技术人员熟知的，例如eco细胞、pg13细胞、hek293细胞、cho细胞、293t细胞、293细胞、mdck细胞、nih3t3细胞、pa317细胞、cos细胞、hela细胞、vero细胞、psicrip细胞等。在本发明的一个或多个实施方案中，所述宿主细胞（包装细胞）为vero细胞。

15、上述方法中，所述核酸分子的核苷酸序列可如seq id no.1所示。

16、上述方法中，所述辅助质粒可为将编码病毒拯救所需蛋白质的核酸分子克隆到表达载体中得到的重组表达载体。所述表达载体不限于特定的载体，本领域技术人员可采用合适的表载体，例如pcdna3.1(-)、pcdna3.1(+)、pyes2.0、pbi121和ppic9k等。只要该表达载体能够表达所述病毒拯救所需蛋白质即可。

17、所述病毒拯救所需蛋白质包括水疱性口炎病毒n蛋白、水疱性口炎病毒p蛋白、水疱性口炎病毒l蛋白、水疱性口炎病毒m蛋白、水疱性口炎病毒g蛋白和t7 rna聚合酶。

18、上述方法中，所述水疱性口炎病毒载体可为rvsv-g δm51。

19、所述载体rvsv-g δm51的核苷酸序列的genebank登录号为：nc_038236.1（11162bp）。

20、进一步地，本文所述重组水疱性口炎病毒载体还可包括报告基因。

21、进一步地，可将报告基因导入到所述水疱性口炎病毒载体（如rvsv-g δm51）中。

22、进一步地，所述报告基因可包括但不限于β-葡糖醛酸酶（gus）基因、荧光素酶（luciferase）基因、氯霉素乙酰转移酶（cat）基因、β-半乳糖苷酶（β-gal）基因、分泌性人胎盘碱性磷酸酶（seap）基因、黄色荧光蛋白（yfp）基因和绿色荧光蛋白（gfp）基因。在本发明的一个或多个实施方案中，所述报告基因为gfp基因。

23、本文中任一所述的重组水疱性口炎病毒载体也在本发明的保护范围内。

24、本发明还提供了由本文中任一所述的重组病毒或所述重组水疱性口炎病毒载体制备得到的疫苗。

25、所述疫苗的活性成分可包括本文中任一所述的重组病毒。

26、所述疫苗可用于预防狂犬病病毒感染或狂犬病；所述疫苗还可用于提供针对狂犬病病毒的免疫应答。

27、所述疫苗还可包括佐剂（adjuvant）。

28、术语“佐剂”是指一种可以刺激机体产生针对与其一同接种的抗原更强烈体液和/或细胞免疫应答的物质。本文所述佐剂是本领域技术人员公知的，包括但不限于：植物佐剂（如烷基胺、酚类成分、奎宁、皂角素、倍半萜、蛋白质、多肽、多糖、糖脂、植物血凝素等）、细菌佐剂（如霍乱毒素、大肠埃希菌不耐热毒素、细菌脂多糖等）、铝佐剂及其他无机成分佐剂（如钙佐剂）、细胞因子和核酸佐剂（如单核细胞克隆刺激因子、白细胞因子il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、ifn-γ、cpg基序、核酸载体等）、乳剂佐剂（如弗氏佐剂）。

29、本发明还提供了本文中任一所述的重组病毒或所述重组水疱性口炎病毒载体在制备预防狂犬病病毒感染或狂犬病的产品（如疫苗）中的应用。

30、本发明还提供了一种制备用于免疫的昆虫的方法，所述方法包括利用本文中任一所述的重组病毒感染昆虫，获得所述用于免疫的昆虫。

31、所述昆虫可为能传播病毒的昆虫，包括但不限于蚊子、白蛉、黑蝇、吸血蠓‌、苍蝇、‌ ‌跳蚤、‌虱子、‌蟑螂、‌臭虫、‌蚂蚁等。‌

32、进一步地，所述昆虫可为蚊科昆虫，例如埃及伊蚊、白纹伊蚊。

33、所述用于免疫的昆虫的制备方法具体可包括采用所述重组病毒和血液的混合物喂养蚊科昆虫。

34、水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，vsv）是一种活病毒疫苗载体，是弹状病毒科的代表模式毒种。其传播媒介包括蚊子，白蛉，黑蝇及吸血蠓等等。通过遗传改造，vsv可以表达外源的抗原蛋白，诱导机体产生针对抗原的特异免疫反应，作为一种疫苗载体应用。

35、对vsv病毒进行分子遗传学研究需要建立一个体系，把dna恢复成有感染性的病毒。本发明通过转染编码病毒转录复合物（n，p，m，l，g）和t7聚合酶的质粒，同时转染的还有编码全长病毒反义基因组的t7启动子质粒。收获的细胞上清被证明含有感染性的病毒颗粒。本发明成功的从dna恢复出有感染性的vsv病毒，使得对vsv进行遗传操作变为可能。带有合适胞质尾的外源病毒功能囊膜蛋白可以有效包装进病毒的囊膜，形成各种携带异源囊膜蛋白的嵌合重组vsv。重组vsv各转录单元之间的非编码区可耐受长达4.5kb外源基因的插入并获得高效表达。作为一种活载体疫苗，vsv具有以下优点：(1)易于培养：vsv在大多数哺乳动物细胞上都可获得很高滴度，容易大量制备。(2)高效性：在vsv-ha感染的小鼠模型中，10个感染性病毒颗粒诱导的免疫应答和105个感染性颗粒引起的免疫应答一样显著。(3)易使用：可通过多种接种途径进行免疫，往往一次接种即可引起强烈的免疫应答反应。(4)能刺激机体产生强烈的细胞免疫反应和体液免疫反应。还能引起较强的粘膜免疫反应：特别适合于通过粘膜感染的呼吸道病原体的疫苗研制。(5)安全性好：由于vsv病毒完全在细胞质中复制，仅从rna→rna，不会整合到宿主细胞的dna中，最终会被宿主免疫系统清除。而且通过反向遗传操作进行基因组突变、修饰，可对vsv病毒进行适当的致弱，使之成为更安全的重组疫苗载体。另外，由于vsv囊膜蛋白同时具有受体识别和膜融合功能，其识别受体广泛存在于各种组织细胞膜表面，使得vsv具极为广泛的组织嗜性。这些特性赋予了vsv作为新型表达载体和活病毒疫苗载体的应用潜力。

36、本发明中利用病毒载体系统(rvsv)，能够直接在动物体内产生具有天然结构和免疫原性的rabv g蛋白，且能够刺激机体的免疫反应，产生能够抵抗狂犬病毒攻击的特异性抗体。本发明中的病毒载体疫苗用于狂犬病免疫更简单和直接，是相较于其他基因工程疫苗和传统的细胞培养疫苗更廉价和高效的疫苗。本发明中rvsv-rabv g-g δm51重组病毒可通过口服方式刺激实验动物产生高水平的特异性中和抗体，百分百保护小鼠免受狂犬病毒攻击。口服免疫途径为野外投放提供了基础。并且该重组病毒可以高效感染埃及伊蚊，通过蚊子携带疫苗递送免疫可以实现对自然疫源地野生动物宿主的免疫。

37、综上，为了实现对于狂犬病的预防，本发明开发了一种基于水疱性口炎病毒载体的病毒疫苗。本发明在水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，vsv）的囊膜蛋白g前插入了狂犬病毒pm1503株的囊膜糖蛋白g，并且恢复了该重组病毒。该重组病毒安全性高，感染巴马猪与小鼠不会造成疫苗载体病毒脱落与传播。且本发明疫苗可高效感染埃及伊蚊，通过蚊子携带递送及口服的方式可诱导机体产生高滴度的中和抗体，保护其免受狂犬病毒的攻击。本发明构建的基于水泡性口炎病毒vsv的重组狂犬病毒，可以用于狂犬病毒疫苗研发和制备，该重组病毒可通过蚊虫媒介携带递送及口服对野生宿主进行狂犬疫苗免疫接种。对自然疫源地的野生动物宿主的免疫接种将对狂犬病毒疫苗的研发及野生动物的保护产生重要意义。