利用重组巴斯德毕赤酵母生产金环蛇抗菌肽的方法

本发明属于生物发酵。

背景技术：

1、蛇毒肽是一类从蛇毒中提取的小分子蛋白质或多肽，这些肽类物质在蛇的毒液中扮演着重要角色，通过多种机制发挥作用，包括干扰神经传递、破坏血液凝固机制、溶解细胞膜等。因其具有很高的生物活性，即使在低浓度下也能产生显著的生理效应，且能快速与其靶点结合并发挥作用，使其在医学研究、药物开发和医美化妆品等领域具有广阔的应用前景。

2、金环蛇属眼镜蛇科环蛇属，目前已从金环蛇蛇毒中发现多种活性成分。金环蛇抗菌肽cathelicin-bf是从金环蛇毒液中分离提取出来的一种抗菌肽,具有广谱抗菌活性。但是由于金环蛇抗菌肽cathelicin-bf的获取和纯化过程复杂且成本高昂，无法满足大规模生产和广泛应用的要求，尽管重组dna技术可以提高产量，但表达系统的选择和优化仍然面临挑战。

技术实现思路

1、本发明的目的是加快酵母生长速度，提高抗菌肽表达产量，缩短发酵周期，降低生产成本，适合金环蛇抗菌肽cathelicin-bf的大规模发酵生产的利用重组巴斯德毕赤酵母生产金环蛇抗菌肽的方法。

2、本发明的步骤是：

3、a、在超净工作台中将金环蛇抗菌肽cathelicin-bf菌种接种至ypd培养基中，30℃摇床培养24 h,转速250rpm，菌体浓度od600=6-8，得一级种子液；

4、b、随后将10×ynb、生物素和一级种子液接种于bmgy培养基中，30℃，转速250rpm，培养24h后得二级种子液；

5、c、配制2.5 l bmmy培养基于5 l发酵罐中，121℃灭菌30min后，用50%氨水调节ph为6.0，将10×ynb、生物素、谷氨酰胺、胆固醇和二级种子液接种至发酵罐中，当溶氧剧烈变化，菌体湿重大于300g/l时，饥饿0.5-1h后，用甲醇诱导金环蛇抗菌肽cathelicin-bf表达，诱导96h结束。

6、本发明bmmy培养基：蛋白胨peptone 20g /l，酵母提取物yeast extract 10 g/l，ynb 13.4 g/l，生物素 0.4 mg/l，胆固醇 10 ml/l，谷氨酰胺 1.8 g/l。

7、本发明10×ynb、生物素、谷氨酰胺、胆固醇不能高温灭菌，无菌抽滤在超净工作台中进行。

8、本发明甲醇的诱导阶段的培养温度为30℃，ph=6.0，转速900 rpm，通气量1.0-1.2vvm，罐压0.08-0.12 mpa。

9、本发明甲醇为工业甲醇。

10、本发明优化过的发酵培养基含有多种生长调节剂，能够有效减轻代谢负担，本发明生产方法在培养基中添加了谷氨酰胺、胆固醇等生物调节剂，有助于调节毕赤酵母细胞新陈代谢，促进酵母细胞生长，加快重组蛋白的表达，且产品纯度高，有利于简化后续的纯化工艺，可以实现金环蛇抗菌肽cathelicin-bf的大规模生产，降低生产成本；运用所述工艺的金环蛇抗菌肽cathelicin-bf的表达量达675.7 mg/l，相较于bmmy培养基优化前的蛋白产量，bmmy培养基优化后的发酵水平提高了17%以上。

技术特征：

1.一种利用重组巴斯德毕赤酵母生产金环蛇抗菌肽的方法，其特征在于：其步骤是：

2.根据权利要求1所述的利用重组巴斯德毕赤酵母生产金环蛇抗菌肽的方法，其特征在于：bmmy培养基：蛋白胨peptone 20g /l，酵母提取物yeast extract 10 g/l，ynb 13.4g/l，生物素 0.4 mg/l，胆固醇 10 ml/l，谷氨酰胺 1.8 g/l。

3.根据权利要求1所述的利用重组巴斯德毕赤酵母生产金环蛇抗菌肽的方法，其特征在于：10×ynb、生物素、谷氨酰胺、胆固醇不能高温灭菌，无菌抽滤在超净工作台中进行。

4.根据权利要求1所述的利用重组巴斯德毕赤酵母生产金环蛇抗菌肽的方法，其特征在于：甲醇的诱导阶段的培养温度为30℃，ph=6.0，转速900 rpm，通气量1.0-1.2vvm，罐压0.08-0.12 mpa。

5.根据权利要求1所述的利用重组巴斯德毕赤酵母生产金环蛇抗菌肽的方法，其特征在于：甲醇为工业甲醇。

技术总结一种利用重组巴斯德毕赤酵母生产金环蛇抗菌肽的方法，属于生物发酵技术领域。本发明的目的是加快酵母生长速度，提高抗菌肽表达产量，缩短发酵周期，降低生产成本，适合金环蛇抗菌肽cathelicin‑BF的大规模发酵生产的利用重组巴斯德毕赤酵母生产金环蛇抗菌肽的方法。本发明在甲醇诱导表达阶段向发酵培养基中加入谷氨酰胺和胆固醇两种生长调节剂，能够有效减轻酵母生长过程中的代谢负担，加快酵母生长速度，促进蛋白质合成，提高抗菌肽的产量。使用本发明的培养基表达金环蛇抗菌肽cathelicin‑BF，可以使蛋白产量提高17％以上，节约了生产成本，特别适用于金环蛇抗菌肽cathelicin‑BF的工业化大规模生产，其发酵产物具有抗衰、抗皱、抗氧化等功能，在医疗、化妆品等领域有着广阔的应用价值和市场前景。技术研发人员：左泽乘,王悦琦,莫伟亮,周增,纪璐瑶受保护的技术使用者：吉林大学技术研发日：技术公布日：2024/12/2