一种SARS-CoV-2的crRNA、引物组、检测体系以及检测方法与流程

本发明涉及病毒检测，特别是涉及一种sars-cov-2的crrna、引物组、检测体系以及检测方法。

背景技术：

1、冠状病毒(coronavirus，cov)是一大类病毒，电镜下形似“皇冠”，直径约80nm～120nm。具有4种主要结构蛋白：刺突糖蛋白(spike，s)、包膜蛋白(envelope protein，e)、膜蛋白(membrane protein，m)和核衣壳蛋白(nucleocapsidprotein，n)。冠状病毒基因组为线性的单股正链rna((+)ssrna)，全长大小为26～32kb，是目前已知rna病毒中基因组最大的病毒之一。冠状病毒属于套式病毒目(nidovirales)，冠状病毒科(coronavirinae)，冠状病毒亚科(coronavirinae)，当前的分类法将冠状病毒亚科分为四个属：α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和δ冠状病毒。冠状病毒可感染哺乳动物和鸟类，主要引起人和动物的多种呼吸道和肠道感染。已发现有七种冠状病毒可使人类致病：hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov、mers-cov及sars-cov-2。前四个冠状病毒已普遍传播，会导致人类轻度呼吸道疾病。但是，sars-cov、mers-cov及sars-cov-2会引起严重呼吸道疾病甚至导致死亡。

2、sars-cov-2为线性单链rna(ssrna)病毒，全基因组序列全长29903bp(登录号mn908947)，共包含14个主要的开放阅读框(open reading frame，orf)。其中，21536bp-25384bp为“s”基因，可编码产生病毒表面糖蛋白s；28274bp-29533bp为“n”基因，可编码产生病毒核衣壳磷蛋白n。sars-cov-2与sars-cov基因组序列相似度为79.5％，与中国菊头蝠sars冠状病毒(bat sars coronavirus)bat-sl-covzc45基因组序列相似性最高，相似度为84％。

3、根据sars-cov-2变异株毒力的不同，危险系数的不同，世界卫生组织(who)将sars-cov-2变异株分成了两大类：需关注的变异毒株(voc,variant ofconcern)和待观察的变异毒株(voi,variant ofinterest)，到目前为止，需要关注变异毒株如下：alpha：其传染力比原始的sars-cov-2病毒株约高出50％，2021年上半年成为主流病毒变异株，但alpha变种可以被治疗性单株抗体、接种疫苗后产生的抗体或感染covid-19康复后所产生的抗体中和；beta：免疫逃逸能力非常强，该毒株具有更高的传染力。虽然对于愈后血清所产生的中和作用已降低，但感染covid-19康复后仍有可能再次被感染。gamma：显著降低对巴姆拉尼维马布和埃特塞维马布单克隆抗体治疗组合的易感性，但其他eua单克隆抗体治疗可用。delta：目前传染性最强的变异株，delta的传染性比alpha高50％，同时也是原始sars-cov-2的两倍，由于rna病毒复制的高突变率，导致随后出现越来越多的的重组毒株在全球流行。

4、快速发现传染源是重大疫情防控的关键。目前sars-cov-2的检测方法主要包含核酸检测、抗体检测、抗原检测几种方法，其中核酸检测是sars-cov-2检测的“金标准”。其是利用pcr技术、核酸测序技术和分子杂交技术来对患者样本中的核酸进行检测，为感染病例确诊提供医学检验证据，为感染者赢得最佳治疗时间，防止病毒进一步传播，降低病毒死亡率。由于sars-cov-2是rna病毒，试剂盒检测基本都采用反转录加实时聚合酶链式反应法(rt-pcr)，扩增病原体的核酸(rna)，同时通过荧光探针实时检测扩增产物。在pcr反应体系中，包含一对特异性引物以及一个taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；如反应体系存在靶序列，pcr反应时探针与模板结合，dna聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针酶切降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条dna链，就有一个荧光分子产生。荧光定量pcr仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，ct值越小。

5、荧光定量pcr法对检测设备或平台要求较高，高灵敏度的rt-pcr仪价格昂贵，对实验室的洁净度和操作人员要求也较高，pcr仪器有检测样本，检测空间，检测通量等限制，没办法进行大规模的检测，这些问题导致确诊的有效率比较低，由于其诸多因素(场地-技术-人员-设备)的限制，重大疫区面临着巨大的临床分子诊断压力。此外，核酸检测耗时较长，考虑到样本运输、样本积压的情况，通常最快4小时才可以报告结果；而抗体检测，一般患者在被感染7-14天后，血清中才出现igm、igg抗体，不能达到早期诊断的目的，检测速度慢、易污染步骤较为繁琐；胶体金免疫法通量不高，试纸的准确性高度依赖于抗体的特异性，如果抗体质量不好，很容易有交叉反应，造成误判。快速、准确且经济是对理想诊断方式的基本要求，此外还应该兼顾操作的简便性(操作不需要专业人员、简单培训即可)、尽量避免专业设备和过强的基础设施要求(如电力条件等)。所以迫切需要一种能在野外或条件简陋地区且不需要昂贵仪器和复杂操作的检测方法，且能与便携式的信号采集器和智能手机结合进行大数据的收集，是快速反应和防控重大疫情传播的关键。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种sars-cov-2的crrna、引物组、检测体系以及检测方法，以解决上述现有技术存在的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明技术方案之一，一种crrna，其核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。

4、本发明技术方案之二，一种raa扩增引物组，由如seq id no.3所示的上游引物和如seq id no.4所示的下游引物组成；或者由如seq id no.5所示的上游引物和如seq idno.6所示的下游引物组成。

5、本发明技术方案之三，一种sars-cov-2的crispr-cas13a检测体系，包括所述crrna和cas13a蛋白。

6、本发明技术方案之四，一种非疾病检测或治疗目的地sars-cov-2的检测方法，包括以下步骤：以待测样本dna为模板，利用所述raa扩增引物组进行扩增反应，再利用所述crispr-cas13a检测体系对扩增产物进行酶切反应，根据反应完成后的荧光颜色判断待测样本中是否含有sars-cov-2。

7、本发明技术方案之五，一种检测sars-cov-2的产品，包括所述raa扩增引物组和/或所述crispr-cas13a检测体系。

8、基于上述技术方案，本发明具有以下技术效果：

9、1.本发明建立的检测方法，对于疑似病毒核酸阳性样品，只要增加反应时间或者联用两个crrna，即可提高荧光数值，进而确定样品阴阳性，极大提高疫情一线sars-cov-2早期监测。

10、2.本发明建立的检测方法另一优势为筛选到效果最好的crrna，使本发明建立的方法灵敏度进一步提高。crispr/cas13a检测方法的核心在于crrna，故crrna与灵敏度、精准度直接相关。在20个crrna中，通过crispr/cas13a检测，crrna5、crrna15荧光值最高，说明这2个效果最好，灵敏度最高。本发明利用真核表达系统，真核cas13a蛋白的表达和纯化，降低了试剂成本。

11、3.本发明建立的检测方法再一优势为成本低，无需昂贵仪器设备。目前荧光定量pcr仪器昂贵，普通国产价格在15万左右，而本发明建议的检测方法只需水浴锅或恒温培养箱及荧光检测仪，所有仪器设备成本不到1万，而且适合一线使用，不需专业规范的实验室。

12、4.本发明建立的检测方法再一优势为检测时间短。目前荧光定量pcr反应时间为1.5-2h，而本发明建立的方法：恒温扩增10min，再用cas13a检测荧光，50min，共计60min。故本发明建立的检测方法更有利于早期快速检测sars-cov-2，对早期sars-cov-2防控非常重要。

13、5.本发明建立的检测方法所选择的靶向区为高保守区，在目前全球的各种突变株中都保持未变，所以可以检测所有的sars-cov-2突变株。

14、本发明建立的crispr-cas13a检测体系，利用cas13a蛋白的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术，该系统包含cas13a、对应的靶向待检测病毒的sgrna和包含一个切割后可发出荧光的报告rna链；当cas13蛋白识别到靶向rna链时会切割相应的模板，随后激活了它的collateral cleavage附属活性，进而切割报告rna并释放可检测的荧光信号，实现了对痕量核酸快速、廉价、高灵敏的检测，针对sars-cov-2最低检出限为1拷贝/微升。本发明可直接检测经过简单处理的临床样本，样本用量极少且无需贵重仪器设备，操作极其简便，此外还具有极高的灵敏度和特异度。已具有发展成为理想的核酸快速精准检测技术的潜力。可用于在资源匮乏地区或野外初步筛选出新冠等呼吸道病毒感染人群，防止病毒进一步扩散，有利于疫情防控。加之，检测由便携式蓝光扫描仪读取，大大加快疫情的反应速度。