一种DABS-Cl柱前衍生检测茶氨酸和γ-氨基丁酸的方法与流程

本发明涉及高效液相色谱法检测食品原料，尤其是一种dabs-cl柱前衍生检测茶氨酸和γ-氨基丁酸的方法。

背景技术：

1、近几年，新食品原料不断发展，逐步走进大众视野，截止到2024年8月已有161种新食品原料被允许使用。新食品原料种类繁多，其中氨基酸类的新食品原料有两种，分别是茶叶茶氨酸和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，gaba)。

2、茶氨酸为茶叶中特有的氨基酸，是茶叶生津润甜的主要成分，可提高人体免疫力和记忆能力、抗抑郁、降血压、消除疲劳、影响脑内神经传达物质的表达。gaba是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，具有改善睡眠、增强肝肾功能、辅助降血压和降血糖、抗焦虑、抗肿瘤等多种生理活性。

3、在食品市场中，茶氨酸和γ-氨基丁酸常常同时被添加进糖果和饮品中用于日常化的减压助眠。茶氨酸可以利用近红外光谱检测技术结合化学计量方法进行检测，但红外光谱易受到其他因素干扰，且光谱数据需进行预处理，建模方法复杂，并不适合日常定量检测；茶氨酸可采用高相液相色谱法进行分析，但因其保留性质弱，且茶氨酸与亲水性侧链氨基酸，如γ-氨基丁酸无明显的差异性分离，导致色谱峰重叠，故茶氨酸直接上机检测分离性差，易受干扰，也不适用于日常检测；高尧华等人将绿茶样品经乙腈提取，psa和c18quechers方法净化，结合气相色谱/串联三重四级杆质谱多反应监测模式对茶氨酸进行定性定量分析；段联勃等人采用超高效液相色谱-串联质谱法测定武夷岩茶中茶氨酸的含量；移瑞瑞等人以甲醛和硼氢化钠为主要衍生试剂，对茶氨酸进行柱前衍生，再经过毛细管电泳-电致化学发光法进行测定。对于γ-氨基丁酸的检测，卢雪伟等人基于gaba在碱性溶液中与次氯酸盐和苯酚反应生成蓝绿色物质，通过检测该有色物质的吸光度值建立比色法从而对gaba进行定量分析，但该法易受样品中其他成分干扰，不适用成分复杂样品的测定；刘镇等人使用液相色谱-串联质谱法，以氘代同位素gaba-d6为内标，建立酒类食品中gaba的检测方法；程威威等人以邻苯二甲醛为衍生化试剂，建立了发芽糙米中gaba的定量检测方法。茶氨酸和γ-氨基丁酸的检测方法多种多样，经过比较，发现两者均可进行衍生化后再经高效液相色谱仪测定，涂云飞等人就采用邻苯二甲醛及n-乙酰-l-半胱氨酸为衍生试剂，建立高效液相色谱法对茶叶中茶氨酸和γ-氨基丁酸的含量进行测定。

4、茶氨酸和γ-氨基丁酸这两种非蛋白类氨基酸由于缺少紫外吸收官能团，很难通过紫外检测器进行检测，而衍生化可以嫁接发光基团，进而使得氨基酸可以被紫外检测器检测。常用的衍生试剂有丹磺酰氯、邻苯二甲醛(opa)、异硫氰酸苯酯(pitc)、2,4-二硝基氟苯(fdnb)等。但是，这些试剂存在多种问题，例如邻苯二甲醛与γ-氨基丁酸的结合产物不稳定，在半小时之后就开始分解，不适用于大批量样品的分析测定；异硫氰酸苯酯衍生化必须在严格无水的条件下进行，这给实验环境以及实际操作带来一定的麻烦。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有的茶氨酸和γ-氨基丁酸这两种物质检测存在的问题，提供一种dabs-cl柱前衍生检测茶氨酸和γ-氨基丁酸的方法。

2、发明人发现，邻苯二甲醛与γ-氨基丁酸的结合产物不稳定，在半小时之后就开始分解，不适用于大批量样品的分析测定；2,4-二硝基氟苯衍生试剂对样品有干扰，且属于剧毒物质，有强致癌性，一般不采用；丹磺酰氯衍生时间较长，且价格偏贵。4-二甲氨基偶氮苯-4’-磺酰氯(dabs-cl)与茶氨酸和γ-氨基丁酸结合后的衍生物稳定且灵敏度高，实验操作简单，衍生时间和试剂价格合理，是理想的柱前衍生试剂。因此，发明人利用dabs-cl对茶氨酸和γ-氨基丁酸进行衍生，建立同时检测茶氨酸和γ-氨基丁酸的高效液相色谱法。

3、具体方案如下：

4、一种dabs-cl柱前衍生检测茶氨酸和γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：

5、s1、样品处理，获得均一的待检测样品；

6、s2、提取：称取所述待检测样品至离心管内，加入超纯水，涡旋震荡，室温下超声提取后离心，上清液转移至容量瓶中，样品残渣再用超纯水按上述步骤提取一次，合并两次上清液，最后用超纯水定容，并摇匀，得样品液；

7、s3、衍生化：精密量取所述样品液1ml，加入50-100μl的碳酸氢钠缓冲液和1.0-1.4ml的4-二甲氨基偶氮苯-4’-磺酰氯，混匀，70-90℃恒温水浴中反应15-20min；取出后冷却至室温，过滤膜，得到衍生化样品；

8、s4、色谱检测：对所述衍生化样品进行色谱检测，色谱柱采用capcellpakadme hr色谱柱；流动相a为含dmf的乙酸钠水溶液；流动相b为乙腈；dad检测波长：463nm，进行色谱检测，得到色谱图和峰面积；

9、s5、线性拟合

10、获得不同浓度的茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合标准工作液，按照s3和s4步骤进行检测，根据检测结果绘制标准曲线，得到线性回归方程；将s4中得到的所述待检测样品的峰面积代入线性回归方程，计算所述待检测样品中的茶氨酸和γ-氨基丁酸含量。

11、进一步地，s1中对于固体样品，先均匀混合，用粉碎机充分粉碎成细小颗粒，均质，装入密封样品袋，干品常温保存，湿品冷冻保存，以备用；对于液体食品，均质后装入密封样品瓶，冷藏保存。

12、进一步地，s2中称取所述待检测样品至50ml离心管内，加入25ml超纯水，涡旋震荡10min，室温下超声提取20min后于8000r/min离心3min，上清液转移至50ml容量瓶中，样品残渣再用20ml超纯水按上述步骤提取一次，合并两次上清液，最后用超纯水定容，并摇匀，获得样品液。

13、进一步地，s4中洗脱采用梯度洗脱，如下：

14、

15、进一步地，s4中色谱柱的尺寸为4.6mml.d.×250mm，5μm。

16、进一步地，s4中色谱柱的柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl。

17、进一步地，s3中所述滤膜的孔径为0.22μm。

18、进一步地，s4中流动相a为20-30mmol/l乙酸钠水溶液，含2-5wt％dmf，ph＝6-7。

19、进一步地，茶氨酸和γ-氨基丁酸在1～100μg/ml内，呈现线性关系，相关系数r2分别为0.9996和0.9995，加标回收率均在93.95％～105.36％范围内，rsd为0.99％～3.93％。

20、进一步地，茶氨酸检出限为0.6mg/kg，定量限为1.7mg/kg；γ-氨基丁酸检出限为0.2mg/kg，定量限为0.6mg/kg。

21、有益效果：本发明建立了dabs-cl柱前衍生同时测定茶氨酸和γ-氨基丁酸这两种氨基酸类的新食品原料的分析方法。

22、首先，本发明考察了不同色谱柱的分离效果，优化了流动相比例梯度。研究表明，capcellpakadme hr色谱柱可以实现其他色谱柱所不能达到的分离效果，提高检测目标和衍生剂的分离度，从而更容易实现洗脱分离。

23、其次，本发明探究了衍生温度、衍生时间、缓冲液的添加量和衍生剂的添加量这四种因素对响应峰面积的影响，发现最佳衍生条件：吸取1ml的样品液或标准液于带塞试管中，加入50μl的碳酸氢钠缓冲液和1ml的dabs-cl衍生剂，在70℃恒温水浴20分钟。

24、最后，按照本发明所建立的方法，茶氨酸和γ-氨基丁酸在1～100μg/ml内，呈现良好的线性关系，相关系数(r2)为0.9996和0.9995，加标回收率均在93.95％～105.36％范围内，rsd控制在0.99％～3.93％。该方法的茶氨酸检出限为0.6mg/kg，定量限为1.7mg/kg；γ-氨基丁酸检出限为0.2mg/kg，定量限为0.6mg/kg。

25、综上，本发明提供的方法前处理易操作，衍生体系简单，衍生时间较短，且具有良好的精密度和重现性，衍生产物在24h内稳定，适用于大批量检测不同食品基质中的茶氨酸和γ-氨基丁酸的含量，也为后续氨基酸类新食品原料的申报与检测提供一定分析方法。