一种定量聚合酶链反应的肘点CT值自动计算方法与流程

本发明涉及生物信息，具体涉及一种定量聚合酶链反应的肘点ct值自动计算方法。

背景技术：

1、实时荧光定量聚合酶链式反应（pcr）技术由于具有实时、灵敏、特异等优点，已经成为分子研究的主要手段之一，广泛应用于分子生物学和医学研究及临床。但是普通的实时定量pcr受荧光检测通道限制，单次反应只能分析单个靶序列，使其在科学研究中的使用受到限制。基于多色荧光检测和分析技术的多重定量pcr方法，通过在一个反应体系内标记不同荧光染料，可实现一次反应检测和多个靶序列检测。

2、目前在做定量计算的仪器中，多数采用手动阈值的方法，需要人工判定和去除各种异常状况，自动获取ct值的传统方法是取扩增前的一段基线数值的方差的8-10倍作为找肘位（肘点）的基准基线，但这种算法存在的问题显而易见会受到前面基线不稳定的影响，特别在前5个循环，试剂的初始温度与仪器内部温度以及试剂自己的特性的相互作用，导致这一段时间出现波动很大，也常常延伸到后面，经常可见向下或者向上的一个倾斜。

3、总的来说，对于ct值计算的方法有数学算法可包括期望最大化、最近邻分析、基本模型参数化、贝叶斯估计或其组合。这些数学算法是很多设备中实际使用的方法，但实际上还没有一种方法能够超越手动阈值法，原因是这些方法更多从数学出发，或者掩盖了信号的原本状态，或者牺牲了扩增过程很多信号的特征。因此，虽然qpcr技术已经应用这么多年，但要自动的得到准确的定量，仍是实时荧光定量pcr技术的一个难点。

技术实现思路

1、为了实现实时荧光定量pcr的自动测量，本发明提出了一种定量聚合酶链反应的肘点ct值自动计算方法，包括步骤：

2、s1：获取定量聚合酶链反应过程中预设循环次数下的原始荧光值扩增曲线；

3、s2：根据前预设个循环的荧光值进行扩增曲线初步判断，并在判断存在有效扩增曲线后进入下一步骤，否则结束；

4、s3：根据原始荧光值进行线性判定下的扩增曲线分型，并基于扩增曲线指数扩增期的曲线变化特点进行肘点近似点位的筛选，基于扩增曲线饱和平台期的曲线变化特点进行膝点近似点位的筛选；

5、s4：根据肘点近似点和膝点近似点之间的原始荧光值扩增曲线进行拟合，基于最优拟合后的方程为线性区方程；

6、s5：根据肘点近似点之前的原始荧光值扩增曲线进行拟合，基于最优拟合后的方程为基线区方程；

7、s6：基于线性区方程与基线区方程进行交点求解，并将该交点作为目标肘点ct值。

8、进一步地，所述s2步骤中，通过拟合前预设个循环的荧光值为一条直线，并与该部分对应的原始荧光扩增曲线进行差值比对，当存在任一点开始差值连续大于零，则判断存在有效扩增曲线。

9、进一步地，所述s3步骤中，扩增曲线分型包括基线区、指数扩增区、线性增长区、对数增长区和饱和平台区。

10、进一步地，所述s3步骤中，通过搜索循环点位间荧光值变化趋势稳定的起止端点进行扩增曲线的分型，其中，循环点位间荧光值变化趋势通过如下公式判定：

11、

12、式中，为循环点位间荧光值变化趋势，c为大于等于1的梯格常数，为第n次循环时的荧光值，通过搜索对应的循环点位进行起止端点的获取。

13、进一步地，所述s3步骤中，扩增曲线指数扩增期的曲线变化特点为由基线区的低荧光值状态进入荧光值指数增长的指数增长区，其中，肘点的荧光值增长速度趋势通过如下公式判定：

14、

15、式中，为肘点的荧光值增长速度趋势，通过搜索原始荧光值扩增曲线中起始低荧光值并接着指数增长范围内对应的循环点位进行肘点近似点位的筛选。

16、进一步地，所述s3步骤中，扩增曲线饱和平台期的曲线变化特点为由线性区的荧光值线性增长转入对数增长区后最终进入停滞增长的饱和平台区，其中，膝点的荧光值增长速度趋势通过如下公式判定：

17、

18、式中，m为最大荧光值，n为系统噪声基线，为修正后第n次循环时的荧光值，为膝点的荧光值增长速度趋势，通过搜索原始荧光值扩增曲线中荧光值对数增长并最终进入停滞增长范围内对应的循环点位进行膝点近似点位的筛选。

19、进一步地，所述s4步骤中，拟合后的线性区方程表示为：

20、

21、所述s5步骤中，拟合后的基线区方程表示为：

22、

23、式中，x为循环次数，y为荧光值，为线性区方程最优拟合下的拟合参数，为基线区方程最优拟合下的拟合参数，b为用户自定义阈值。

24、与现有技术相比，本发明至少含有以下有益效果：

25、本发明所述的一种定量聚合酶链反应的肘点ct值自动计算方法，利用线段的特征进行分段，分段后再进行拟合，利用拟合线特征计算ct简洁有效的模型，利用分段的拟合线特征计算ct 值，它的结果完全反应了原始扩增曲线的特征，它针对弱阳性等低浓度样本会有更好的符合特性和更真实的效果。同时，相对定量结果cv更稳定。

技术特征：

1.一种定量聚合酶链反应的肘点ct值自动计算方法，其特征在于，包括步骤：

2.如权利要求1所述的一种定量聚合酶链反应的肘点ct值自动计算方法，其特征在于，所述s2步骤中，通过拟合前预设个循环的荧光值为一条直线，并与该直线对应的原始荧光扩增曲线进行差值比对，当存在任一点开始差值连续大于零，则判断存在有效扩增曲线。

3.如权利要求1所述的一种定量聚合酶链反应的肘点ct值自动计算方法，其特征在于，所述s3步骤中，扩增曲线分型包括基线区、指数扩增区、线性增长区、对数增长区和饱和平台区。

4.如权利要求3所述的一种定量聚合酶链反应的肘点ct值自动计算方法，其特征在于，所述s3步骤中，通过搜索循环点位间荧光值变化趋势稳定的起止端点进行扩增曲线的分型，其中，循环点位间荧光值变化趋势通过如下公式判定：

5.如权利要求4所述的一种定量聚合酶链反应的肘点ct值自动计算方法，其特征在于，所述s3步骤中，扩增曲线指数扩增期的曲线变化特点为由基线区的低荧光值状态进入荧光值指数增长的指数增长区，其中，肘点的荧光值增长速度趋势通过如下公式判定：

6.如权利要求4所述的一种定量聚合酶链反应的肘点ct值自动计算方法，其特征在于，所述s3步骤中，扩增曲线饱和平台期的曲线变化特点为由线性区的荧光值线性增长转入对数增长区后最终进入停滞增长的饱和平台区，其中，膝点的荧光值增长速度趋势通过如下公式判定：

7.如权利要求1所述的一种定量聚合酶链反应的肘点ct值自动计算方法，其特征在于，所述s4步骤中，拟合后的线性区方程表示为：

技术总结本发明公开了一种定量聚合酶链反应的肘点CT值自动计算方法，涉及生物信息技术领域，主要包括步骤：根据原始荧光值进行线性判定下的扩增曲线分型，并基于扩增曲线指数扩增期的曲线变化特点进行肘点近似点位的筛选，基于扩增曲线饱和平台期的曲线变化特点进行膝点近似点位的筛选；根据肘点近似点和膝点近似点之间的原始荧光值扩增曲线进行拟合，基于最优拟合后的方程为线性区方程；根据肘点近似点之前的原始荧光值扩增曲线进行拟合，基于最优拟合后的方程为基线区方程；基于线性区方程与基线区方程进行交点求解，并将该交点作为目标肘点CT值。本发明所获得的结果完全反应了原始扩增曲线的特征，所获得的定量结果更加稳定。技术研发人员：李宝连,郭学全,梁育受保护的技术使用者：宁波海尔施基因科技股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/12/2