一种发酵制备5-氨基乙酰丙酸的方法与流程

本发明属于5-氨基乙酰丙酸的发酵，具体涉及一种发酵制备5-氨基乙酰丙酸的方法。

背景技术：

1、5-氨基乙酰丙酸（5-ala）是四氢吡咯（四氢吡咯是构成血红素、细胞色素、维生素b12）的前缀化合物，是生物合体合成叶绿素、血红素、维生素b12等必不可少的物质；5-ala作为一种环境相容性及选择性很高的物质，在医药领域和农业领域具有重要的应用价值；医学上5-ala作为一种新型光动力药物，不仅用于局部或全身的皮肤癌的治疗，还可用于膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断；在农业领域，其可以作为植物生长调节剂，提高光合效率，促进光合作用，参与植物生长发育的调节过程；还可以作为绿色除草剂，杀虫剂等。

2、目前，生产5-ala的方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，关于化学合成法，研究者先后以马尿酸、琥珀酸、四氢糠胺以及乙酰丙酸等为原料合成了5-ala，但是其存在试剂价格高不易获取、毒性高、收率低、反应条件苛刻等缺点。

3、关于微生物发酵法，cn118109527a公开了一种采用构巢曲霉发酵产5-氨基乙酰丙酸的工艺，包括以下步骤：构建构巢曲霉工程菌株，制备构巢曲霉孢子液，发酵制备5-氨基乙酰丙酸，外源添加磷酸吡哆醛和铁离子，调整转速及ph，在此基础上，外源添加乙酰丙酸，并采用5l发酵罐补料发酵。

4、该专利通过对菌株进行外源添加，优化发酵条件，提高5-氨基乙酰丙酸产量至4.134±0.256g/l，但是发酵时间较长，降低了产率。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的技术问题，本发明提供了一种发酵制备5-氨基乙酰丙酸的方法，缩短了发酵时间，提高了产量。

2、针对上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

3、1.活化培养

4、将谷氨酸棒杆菌进行置于活化培养基中进行活化培养，培养时间为23-25h，培养温度为28-30℃，得到活化培养液；

5、所述谷氨酸棒杆菌由市场购买所得；

6、所述活化培养基的成分为，胰蛋白胨10.2—10.6g/l、硫酸镁0.7-0.9g/l、琼脂1.8-2.2g/l、酵母浸膏3.4-4.0g/l、氯化钠0.8-1.2g/l，ph为6.5-6.7。

7、2.一级种子培养

8、将活化培养液按照0.25%的接种量接种于一级种子培养基上进行一级种子培养，得到一级种子培养液；一级种子培养条件为，培养温度为28-30℃，转速为195-206rpm，培养时间为16-18h；

9、所述一级种子培养基的成分为，葡萄糖8.5-9.0g/l、胰蛋白胨7.2-7.6g/l、酵母粉12.1-12.5g/l、磷酸氢二钾1.0-1.4g/l、磷酸二氢钾0.8-1.2g/l、生长剂1.1-1.3g/l；

10、所述生长剂为硫胺素和芸苔素内酯，所述硫胺素和芸苔素内酯的质量比为1.2-1.4:1.6-1.8。

11、3.二级种子培养

12、将一级种子培养液按照5%的接种量接种于二级种子培养基上进行二级种子培养，得到二级种子培养基；二级种子培养条件为，培养温度为30-33℃，转速为215-225rpm，培养时间为19-22h；

13、所述二级种子培养基的成分为，葡萄糖6.7-7.2g/l、胰蛋白胨6.0-6.5g/l、硫酸镁0.6-1.0g/l、feso4·7h2o 0.8-1.2g/l、硫酸铵0.7-1.1g/l、稳定剂0.30-0.35g/l；

14、所述稳定剂为钴胺素、甘露醇的混合物，所述钴胺素、甘露醇的质量比为1:0.8-1.2。

15、4.发酵培养

16、将二级种子培养液按照10%的接种量接种于发酵培养基上进行发酵培养，发酵过程中，控制搅拌转速为263-274rpm，发酵温度为35-37℃，压力为0.05-0.07mpa，并用24-26wt%氨水溶液控制ph值为6.2-6.5，发酵第0-24h控制溶氧量为28-32%，发酵24h后至发酵终点，控制溶氧量为9-11%，在发酵至第2.5h时，加入终浓度为0.08-0.12mmol/l的iptg诱导剂和终浓度为3.8-4.2g/l的甘氨酸溶液，在发酵至第14h时，流加发酵促进剂，流加速度为0.04-0.06g/h/l，流加时间为4.0-4.4h，控制发酵周期为34.8-35.1h，制得发酵培养液；

17、所述发酵培养基的成分为，葡萄糖16.4-17.0g/l、胰蛋白胨9.6-10.0g/l、硫酸锰0.013-0.017g/l、氯化铵3.0-3.4g/l、发酵营养液1.4-1.6g/l；

18、所述发酵营养液的制备方法为，向去离子水中加入异亮氨酸、天冬氨酸，升高温度至35-37℃，在242-255rpm下搅拌27-33min，搅拌结束后，加入槐糖脂和甘油，进行超声处理，超声时间为14-17min，超声频率为23-28khz，超声功率为225-234w，超声结束后，制得发酵营养液；

19、所述去离子水、异亮氨酸、天冬氨酸、槐糖脂和甘油的质量比为13.7-14.1:2.5-2.7:2.6-3.0:0.8-1.2:1.2-1.6；

20、所述发酵促进剂是由油酸、谷胱甘肽组成，所述油酸、谷胱甘肽的质量比为1.6-1.8:1.0-1.2。

21、与现有技术相比，本发明取得了以下有益效果：

22、1.本发明对谷氨酸棒杆菌进行了两级种子培养，在一级种子培养过程中加入了生长剂，其可以促进菌体的细胞分裂和生长，刺激生长和繁殖，缩短了菌种在种子培养基中的延迟，有利于提高在发酵中后期菌种的活性，并且促进糖类的分解代谢，为微生物的生长提供能量，在提供营养的同时加快菌种的生长代谢速度，进而增加5-ala 产量，在二级种子培养中，加入稳定剂，其可以优化微生物的代谢途径，提供碳源和能量，促进菌体的生长和代谢，为后续的发酵过程提供充足的接种量和高密度的微生物种群，改善发酵的一致性和发酵效率；在发酵步骤中，发酵培养基中特定的发酵营养液，其中的氨基酸和甘油成分，主要是提供能源被微生物利用，促进微生物的代谢，提高生产效率，而槐糖脂可以降低表面张力，增加细胞通透性，改善菌体与培养基之间的相互作用，从而提高菌体对于营养物质的吸收和利用率，减少能量的消耗，提高产酸性能，提高5-氨基乙酰丙酸的产量；其结合发酵促进剂，调节微生物细胞膜的流动性，保护菌种在发酵过程中的稳定性，在各种助剂的共同作用下，促进了发酵过程的进行和5-氨基乙酰丙酸的积累，降低副产物的含量，实现了5-ala的产量进一步提高；

23、2.采用本发明的方法得到的发酵培养液，5-ala的含量为21.2-21.8g/l，乳酸的含量为1.09-1.14g/l，乙酸的含量为0.64-0.68g/l。

技术特征：

1.一种发酵制备5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，包括活化培养、一级种子培养、二级种子培养以及发酵培养步骤；

2.根据权利要求1所述的一种发酵制备5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，

3.根据权利要求1所述的一种发酵制备5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，

4.根据权利要求1所述的一种发酵制备5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，

5.根据权利要求1所述的一种发酵制备5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，

6.根据权利要求1所述的一种发酵制备5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，

技术总结本发明提供了一种发酵制备5‑氨基乙酰丙酸的方法，属于5‑氨基乙酰丙酸的发酵技术领域；所述方法包括活化培养、一级种子培养、二级种子培养以及发酵培养；所述发酵培养步骤包括，在发酵至第14h时，流加发酵促进剂，流加速度为0.04‑0.06g/h/L，流加时间为4.0‑4.4h，控制发酵周期为34.8‑35.1h，制得发酵培养液；所述发酵营养液的制备方法为，向去离子水中加入异亮氨酸、天冬氨酸，升高温度至35‑37℃搅拌，然后加入槐糖脂和甘油，进行超声处理，制得发酵营养液；采用本发明的方法制得的发酵培养液，5‑氨基乙酰丙酸的含量高，副产物含量低。技术研发人员：高世军,王志强,伦学宁,褚玉强,冯伟,王子为,肖树志,李晓磊受保护的技术使用者：山东寿光巨能金玉米开发有限公司技术研发日：技术公布日：2024/12/2