一种用于检测沙门氏菌的RPA组合物、RPA试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及生物，尤其涉及一种用于检测沙门氏菌的rpa组合物、rpa试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、沙门氏菌(salmonella)是一种主要通过食物和水传播的细菌，广泛存在于生肉、禽肉、蛋类和一些未消毒的乳制品中，是导致食源性疾病的重要病原体之一。感染沙门氏菌后，通常会在6至72小时内出现症状，主要包括：腹痛、腹泻(可能伴有脓血)、发热、恶心和呕吐等。虽然大部分感染者会在短期内康复，但沙门氏菌感染可能导致严重的并发症，例如：败血症、肠穿孔、长期关节炎等。

2、沙门氏菌主要通过以下途径传播：首先是食物传播，生或未充分烹饪的肉类、禽肉和蛋类是主要感染来源，交叉污染也常见，尤其在家庭厨房中。其次，水传播也是一个重要途径，饮用被污染的水或食物可能导致感染。此外，在某些情况下，感染者通过接触传播给他人，尤其是在卫生条件不佳的环境中。沙门氏菌的检测方法主要有血清学检测、培养法、elisa法、pcr法等，但上述对检测亚临床动物的灵敏度不足，而较敏感的qpcr等方法操作较复杂、耗时耗力，并且存在一定的误诊率。因此，需要开发一种更为灵敏、准确和快速的检测方法来应对沙门氏菌的挑战。

3、重组聚合酶链式反应(recombinase polymerase amplification,rpa)技术是一种新兴的核酸扩增技术，它在传统的pcr技术基础上进行了改进，具有更高的特异性和灵敏性，且操作相对简单。rpa技术的特异性和灵敏性比pcr技术更优异，能够更准确地检测出目标菌，同时摆脱传统pcr技术对温度调控的依赖，操作过程相对简单，不需要经过变性、退火延伸三个复杂步骤，能够在较短时间内完成检测，提高检测效率。因此，将rpa技术应用于冷冻食品中，能够更灵敏、准确、快速地检测出沙门氏菌。然而，需要注意的是，rpa技术在实际应用中仍需进一步优化和完善，以确保其检测的准确性和可靠性。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于灵敏、准确、快速检测沙门氏菌的rpa组合物、rpa试剂盒及检测方法。

2、本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

3、一种用于检测沙门氏菌的rpa组合物，包括引物组和探针；

4、所述引物组包括上游引物和下游引物，核苷酸序列分别如seq id no.1、seq idno.2所示；

5、所述探针的寡核苷酸序列如seq id no.3所示，且所述探针序列中具有荧光基团fam和猝灭基团bhq1，两个基团之间由四氢呋喃隔开，3’端由c3 spacer修饰，如下所示：

6、taatgcagctcgaaacgaacattgaagcgt[fam-dt]g[thf]c[bhq1-dt]gaatttattcgtct-c3 spacer-3’。

7、一种用于检测沙门氏菌的rpa试剂盒，包括上述rpa组合物。

8、作为本发明的优选方式之一，还包括阳性对照品、阴性对照品以及用于rpa扩增反应的试剂。

9、作为本发明的优选方式之一，所述用于rpa扩增反应的试剂为twistampexo kit试剂，包括无dnase rnase水、缓冲液、醋酸镁等。

10、作为本发明的优选方式之一，所述阳性对照品为沙门氏菌质粒，阴性对照品为去离子水。

11、一种上述试剂盒在检测沙门氏菌中的应用。

12、一种沙门氏菌检测方法，采用上述检测沙门氏菌的rpa试剂盒：

13、(1)通过无菌bpw水袋现场采样；

14、(2)将采集有样品的bpw水高速离心，使所有细菌聚于管底，弃上清；

15、(3)提取步骤(2)管底细菌液的核酸；

16、(4)以步骤(3)所提取的核酸为扩增模板，并采用所述rpa试剂盒进行rpa扩增反应。

17、作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，离心速度为10000rpm，离心时间10min。

18、作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，按照细菌基因组dna提取试剂盒的操作说明，提取沙门氏菌基因组dna，用超纯水溶解后4℃保存备用。

19、作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，rpa反应体系为：10μmol/l上游引物2μl、10μmol/l下游引物2μl、10μmol/l探针0.6μl、2μl dna模板、15.9μl无dnase rnase水以及25μl缓冲液组成预混液，加到0.2ml的twist amp exo反应管中，然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上；rpa扩增反应条件为：扩增温度35～42℃，扩增时间15～20min。

20、本发明相比现有技术的优点在于：

21、(1)本发明以gen bank中沙门氏菌的序列信息，确定保守区域，并结合软件设计特异性rpa引物和探针；采用本发明设计的rpa引物和探针对沙门氏菌进行检测，灵敏性好、特异性强，且检测快速，20min即可出结果，适用于冷冻食品中沙门氏菌的临床诊断与监测；

22、(2)本发明沙门氏菌检测方法的整个过程在25h内(从采样到bpw水袋子开始计算)，相较于国标检测方法(4～7d)，省时省力；

23、(3)本发明通过对rpa反应体系的优化，进一步提高检测效率。

技术特征：

1.一种用于检测沙门氏菌的rpa组合物，其特征在于，包括引物组和探针；

2.一种用于检测沙门氏菌的rpa试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的rpa组合物。

3.根据权利要求2所述的用于检测沙门氏菌的rpa试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品、阴性对照品以及用于rpa扩增反应的试剂。

4.根据权利要求3所述的用于检测沙门氏菌的rpa试剂盒，其特征在于，所述用于rpa扩增反应的试剂为twistamp exo kit试剂。

5.根据权利要求3所述的用于检测沙门氏菌的rpa试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为沙门氏菌质粒，阴性对照品为去离子水。

6.一种如权利要求2～5任一所述的试剂盒在检测沙门氏菌中的应用。

7.一种沙门氏菌检测方法，其特征在于，采用如权利要求2～5任一所述的检测沙门氏菌的rpa试剂盒，方法如下：

8.根据权利要求7所述的沙门氏菌检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，离心速度为10000rpm，离心时间10min。

9.根据权利要求7所述的沙门氏菌检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，按照细菌基因组dna提取试剂盒的操作说明，提取沙门氏菌基因组dna，用超纯水溶解后4℃保存备用。

10.根据权利要求7所述的沙门氏菌检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中，rpa反应体系为：10μmol/l上游引物2μl、10μmol/l下游引物2μl、10μmol/l探针0.6μl、2μl dna模板、15.9μl无dnase rnase水以及25μl缓冲液组成预混液，加到0.2ml的twist amp exo反应管中，然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上；rpa扩增反应条件为：扩增温度35～42℃，扩增时间15～20min。

技术总结本发明提供了一种用于检测沙门氏菌的RPA组合物，包括引物组和探针；引物组包括上游引物和下游引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且探针序列中具有荧光基团FAM和猝灭基团BHQ1，两个基团之间由四氢呋喃隔开，3’端由C3Spacer修饰。本发明还提供了包括上述RPA组合物的RPA试剂盒及其在检测沙门氏菌中的应用。同时，本发明还提供了一种沙门氏菌检测方法。采用本发明设计的RPA引物和探针对沙门氏菌进行检测，灵敏性好、特异性强，且检测快速，适用于冷冻食品中沙门氏菌的临床诊断与监测。技术研发人员：郭学波,吴琼,广敏,郭妮妮,向金梅,宋先荣受保护的技术使用者：汉唐和元（武汉）科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/12/2