一种一步可控接枝合成高载量琼脂糖微球的方法与流程

本发明属于离子交换色谱，尤其涉及一种一步可控接枝合成高载量琼脂糖微球的方法。

背景技术：

1、离子交换色谱是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换的离子通过交换而达到分离纯化效果的技术。离子交换作为色谱技术的核心之一，广泛应用于重组蛋白、抗体和疫苗的纯化过程。要提高对目标蛋白的分离效率不仅要优化层析介质的基质，如基质材料、粒径、孔隙率和孔径分布等因素，更要关注偶联在基质上的功能配基。层析原理是利用层析介质的配基与各组分之间相互作用力的差别，影响各组分的迁移速率，实现目标物分离，其中配基密度对蛋白的吸附与扩散产生重要影响，进而影响蛋白结合驱动力。

2、在琼脂糖微球上接枝葡聚糖分子是一种常用的提高介质载量的方法，但是葡聚糖的空间位阻大，导致在琼脂糖微球内部接枝不充分。

3、申请号为cn201610137281.4的中国专利公开了甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰琼脂凝胶色谱介质及制备方法与应用，但其合成离子型层析介质先合成环氧接枝的接枝，再通过环氧开环引入离子基团，步骤较多。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种一步可控接枝合成高载量琼脂糖微球的方法，该方法可直接引入离子基团合成步骤简单。

2、本发明提供了一种一步可控接枝合成高载量琼脂糖微球的方法，包括以下步骤：

3、s1）在琼脂糖微球上偶联引发剂α-溴异丁酰溴，得到溴化介质；

4、s2）将溴化介质悬浮于第一有机溶剂与水的混合溶液中，并加入溴化铜、2,2'-联吡啶与离子型单体，经通入保护气氛除氧处理后，加入溴化亚铜，在保护气氛中进行反应，得到高载量琼脂糖微球；所述离子型单体包括双键与离子。

5、优选的，所述步骤s1）具体为：

6、将琼脂糖微球进行溶剂梯度替换，然后加入三乙胺，在保护气氛的条件下冰浴搅拌，滴加α-溴异丁酰溴有机溶液后，升温进行反应，得到溴化介质。

7、优选的，所述溶剂替梯度换采用不同浓度的第二有机溶剂与醇溶剂的混合液使琼脂糖微球分散在第二有机溶剂中；所述第二有机溶剂选自二甲亚砜、n,n'-二甲基甲酰胺与四氢呋喃中的一种或多种。

8、优选的，所述三乙胺的体积为琼脂糖微球体积的20%~35%；

9、所述α-溴异丁酰溴有机溶液中α-溴异丁酰溴与溶剂的体积比为1：6~1：15；

10、所述α-溴异丁酰溴有机溶液中α-溴异丁酰溴的体积为琼脂糖微球体积的15%~30%。

11、优选的，所述冰浴搅拌的转速为100~500 rpm；所述冰浴搅拌的时间为0.1~1 h；

12、滴加α-溴异丁酰溴有机溶液在保护气氛中保持10~60 min后，除去保护气氛，再升温进行反应；

13、升温进行反应的温度为20℃~40℃；升温进行反应的时间为8~15 h。

14、优选的，所述第一有机溶剂选自二甲亚砜、n,n'-二甲基甲酰胺与四氢呋喃中的一种或多种；所述第一有机溶剂与水的体积比为1：（0.5~2）。

15、优选的，所述溴化亚铜、溴化铜与2,2'-联吡啶的摩尔比为1：（0.05~0.2）：（1.5~8）；

16、所述溴化介质与溴化亚铜的比例为1 ml：（0.02~0.2）mmol；

17、所述离子型单体与溴化介质的比例为（0.005~0.05）mol：7 ml。

18、优选的，所述离子型单体选自式（1）~式（4）中的一种或多种：

19、式（1）；式（2）；

20、式（3）；式（4）；

21、其中，式（1）~式（4）中的r1各自独立地选自h或c1~c3的烷基；

22、式（1）~式（4）中的r各自独立地选自c1~c10的亚烷基、醚基或酯基；

23、r3与r4各自独立地选自钾或钠。

24、优选的，所述步骤s2）中除氧处理的时间为20~40 min；

25、所述反应的时间为60~360 min；

26、反应结束后，将反应体系暴露于空气中终止反应后，用螯合剂溶液洗涤除去铜离子，得到高载量琼脂糖微球。

27、优选的，所述高载量琼脂糖微球的动态载量大于等于30 mg bsa/ml wet gel或者大于等于70 mg lysozyme/ml wet gel。

28、本发明提供了一种一步可控接枝合成高载量琼脂糖微球的方法，包括以下步骤：s1）在琼脂糖微球上偶联引发剂α-溴异丁酰溴，得到溴化介质；s2）将溴化介质悬浮于第一有机溶剂与水的混合溶液中，并加入溴化铜、2,2'-联吡啶与离子型单体，经通入保护气氛除氧处理后，加入溴化亚铜，在保护气氛中进行反应，得到高载量琼脂糖微球；所述离子型单体包括双键与离子。与现有技术相比，本发明采用原子转移自由基聚合可以较为精确的调节材料表面接枝聚合物的形态、结构以及分子量大小等物理特性，并且使用的原料是化学小分子，避免了大分子之间的空间排阻效应，并且可以轻易的对接枝密度进行控制并实现高密度接枝。

技术特征：

1.一种一步可控接枝合成高载量琼脂糖微球的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s1）具体为：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述溶剂替梯度换采用不同浓度的第二有机溶剂与醇溶剂的混合液使琼脂糖微球分散在第二有机溶剂中；所述第二有机溶剂选自二甲亚砜、n,n'-二甲基甲酰胺与四氢呋喃中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述三乙胺的体积为琼脂糖微球体积的20%~35%；

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冰浴搅拌的转速为100~500 rpm；所述冰浴搅拌的时间为0.1~1 h；

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一有机溶剂选自二甲亚砜、n,n'-二甲基甲酰胺与四氢呋喃中的一种或多种；所述第一有机溶剂与水的体积比为1：（0.5~2）。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溴化亚铜、溴化铜与2,2'-联吡啶的摩尔比为1：（0.05~0.2）：（1.5~8）；

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子型单体选自式（1）~式（4）中的一种或多种：

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s2）中除氧处理的时间为20~40min；

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高载量琼脂糖微球的动态载量大于等于30 mg bsa/ml wet gel或者大于等于70 mg lysozyme/ml wet gel。

技术总结本发明提供了一步可控接枝合成高载量琼脂糖微球的方法，包括以下步骤：S1）在琼脂糖微球上偶联引发剂α‑溴异丁酰溴，得到溴化介质；S2）将溴化介质悬浮于第一有机溶剂与水的混合溶液中，并加入溴化铜、2,2'‑联吡啶与离子型单体，经通入保护气氛除氧处理后，加入溴化亚铜，在保护气氛中进行反应，得到高载量琼脂糖微球；所述离子型单体包括双键与离子。与现有技术相比，本发明采用原子转移自由基聚合可以较为精确的调节材料表面接枝聚合物的形态、结构以及分子量大小等物理特性，并且使用的原料是化学小分子，避免了大分子之间的空间排阻效应，并且可以轻易的对接枝密度进行控制并实现高密度接枝。技术研发人员：刘亚男,唐露苗,李则锐,李林,任磊受保护的技术使用者：山东微领生物有限公司技术研发日：技术公布日：2024/12/2