一种检测肾癌的引物探针组合、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及体外检测，具体地，涉及一种检测肾癌的引物探针组合、试剂盒及应用。

背景技术：

1、肾癌是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内的发病率呈现上升趋势。肾癌的发病率和死亡率在全球范围内都很高，高发病率和死亡率提示了在预防、早期诊断和治疗方面存在挑战。

2、影像学检查肾癌主要依赖于不同的成像技术，这些技术通过揭示肾脏的结构和功能异常来实现对肾癌的诊断和评估。但通常需要放射科医师进行主观的视觉评估和定性描述，可能影响诊断的准确性和可靠性。影像学检查通常无法提供肿瘤的分子和功能信息，而肿瘤的分子特征(如基因突变、蛋白表达等)对于制定个体化治疗方案至关重要。

3、生化标志物在肾癌检测中的应用虽然具有重要价值，但其具有特异性不足、敏感性较低、易受多种因素干扰、治疗反应评估准确性不足以及缺乏统一标准等局限性，限制了其在临床诊断和治疗中的应用。

4、免疫组化检测中，抗体的质量和特异性、复杂的操作过程、结果解读的主观性、高成本、样本质量的依赖性以及特异性限制等因素都可能影响检测的准确性和可靠性。

5、二代测序技术中，测序仪器、试剂和耗材的费用都相对昂贵，再加上复杂的数据分析过程，导致整体检测成本较高。

6、目前仍需要研发出检测快速、操作简便、成本低、特异性好及判读简单的检测产品和方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种检测肾癌的引物探针组合、试剂盒及应用。

2、本发明针对进行甲基化的肾癌样本，设计了引物探针组合，进行qpcr扩增，从而检测肾癌，能够精确识别目标序列，有效避免了非目标序列的干扰，特异性高灵敏度强。

3、本发明的第一个目的是提供一种检测肾癌的引物探针组合。

4、本发明的第二个目的是提供所述引物探针组合在制备检测肾癌试剂盒中的应用。

5、本发明的第三个目的是提供一种检测肾癌的试剂盒。

6、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

7、一种检测肾癌的引物探针组合，所述引物探针组合包括检测sytl3基因、gbx2基因和flrt2基因中的至少一种的引物探针组合；

8、所述检测sytl3基因的引物的核苷酸序列如seq id no：1和2所示，检测sytl3基因的探针的核苷酸序列如seq id no：3所示；

9、所述检测gbx2基因的引物的核苷酸序列如seq id no：4和5所示，检测gbx2基因的探针的核苷酸序列如seq id no：6所示；

10、所述检测flrt2基因的引物的核苷酸序列如seq id no：7和8所示，检测flrt2基因的探针的核苷酸序列如seq id no：9所示。

11、所述sytl3基因在ncbi的gene id为：84958，gbx2基因在ncbi的gene id为：2637，flrt2基因在ncbi的gene id为：23768。

12、在本发明具体实施方式中，所述检测sytl3基因的探针的5'端标记fam荧光基团，3'端标记tamra淬灭基团；

13、所述检测gbx2基因的探针的5'端标记vic荧光基团，3'端标记bhq-2淬灭基团；

14、所述检测flrt2基因的探针的5'端标记tet荧光基团，3'端标记bhq-1淬灭基团。

15、本发明提供了所述引物探针组合在制备检测肾癌试剂盒中的应用。

16、本发明还提供了一种检测肾癌的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的引物探针组合。

17、进一步地，所述试剂盒中还含有dntps。

18、进一步地，所述试剂盒中还含有mgcl2。

19、进一步地，所述试剂盒中还含有rox染料。

20、进一步地，所述试剂盒中还含有无酶核酸水。

21、进一步地，所述试剂盒中还含有阴性对照、阳性对照和无模板对照。

22、进一步地，所述阴性对照为人白细胞dna，所述阳性对照为肾癌细胞dna，所述无模板对照为无酶核酸水。

23、所述试剂盒的使用方法为：

24、1、提取待测样品的dna，取30ng待测样品的dna并进行亚硫酸氢盐转化，得到亚硫酸氢盐转化dna样品。在本发明具体实施方式中，可以用qiaamp circulating nucleicacid kit(厂家：qiagen，货号：no.55114)试剂盒提取待测样品的dna，用ultrafast bisulfite kit进行亚硫酸氢盐转化，得到亚硫酸氢盐转化后的dna样本。

25、2、配置pcr反应体系：

26、所述每孔pcr反应体系由10μl pcr反应混合液和10μl亚硫酸氢盐转化后的dna样本组成，共20μl。

27、10μl pcr反应混合液：200-400μm dntps、2.5-6mm mgcl2、1-3u amplitaq golddna聚合酶、1-3×pcr反应缓冲液、25-60nm rox染料、650-800nm核苷酸序列如seq id no：1所示的引物、650-800nm核苷酸序列如seq id no：2所示的引物、300-500nm核苷酸序列如seq id no：3所示的探针、150-250nm核苷酸序列如seq id no：4所示的引物、150-250nm核苷酸序列如seq id no：5所示的引物、50-150nm核苷酸序列如seq id no：6所示的探针、250-450nm核苷酸序列如seq id no：7所示的引物、250-450nm核苷酸序列如seq id no：8所示的引物和100-250nm核苷酸序列如seq id no：9所示的探针，用无酶核酸水补至pcr反应混合液总体积为10μl。上述pcr反应混合液中各成分的浓度都为在20μl pcr反应体系中的终浓度。

28、优选10μl pcr反应混合液：300μm dntps、3mm mgcl2、2u amplitaq gold dna聚合酶、1×pcr反应缓冲液、30nm rox染料、700nm核苷酸序列如seq id no：1所示的引物、700nm核苷酸序列如seq id no：2所示的引物、350nm核苷酸序列如seq id no：3所示的探针、200nm核苷酸序列如seq id no：4所示的引物、200nm核苷酸序列如seq id no：5所示的引物、100nm核苷酸序列如seq id no：6所示的探针、300nm核苷酸序列如seq id no：7所示的引物、300nm核苷酸序列如seq id no：8所示的引物和150nm核苷酸序列如seq id no：9所示的探针，用无酶核酸水补至pcr反应混合液总体积为10μl。上述pcr反应混合液中各成分的浓度都为在20μl pcr反应体系中的终浓度。

29、amplitaq gold dna聚合酶厂家为thermo，货号为n8080010，pcr反应缓冲液为amplitaq gold dna聚合酶中的配套缓冲液。

30、pcr扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性15s，63℃退火和延伸30s，45个循环。

31、pcr反应结束后，将ct阈值设定在线性扩增区间(本实验中，设定δrn为0.15)。

32、3、判定标准

33、靶点1(sytl3基因)的ct值小于38.7，靶点2(gbx2基因)的ct值小于38.4，靶点3(flrt2基因)的ct值小于38.9。

34、以上3个条件至少满足一项，则样本检测为阳性；而当样本同时不满足靶点1的ct值小于38.7、靶点3的ct值小于38.4、靶点2的ct值小于38.9时，样本检测为阴性。

35、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

36、本发明针对进行甲基化的肾癌样本，设计了引物探针组合，进行qpcr扩增，从而检测肾癌。本发明的引物探针组合，能够精确识别目标序列，有效避免了非目标序列的干扰，特异性高灵敏度强。通过设计的引物探针组合开发了一种检测肾癌的试剂盒，操作步骤简单直观，比起高通量测序测序文库构建时所需的繁琐的检测流程，本试剂盒的操作更易于实验室技术人员快速掌握和实施。试剂盒相较于高通量测序，不仅减少了昂贵的测序费用，而且大大缩短了检测时间，在保证检测质量的同时，有效降低了检测成本。这种成本效益的提高，使得更多的病患能够获得及时且准确地进行肾癌检测，有助于肾癌的早期发现和治疗，从而提高了治疗的可及性和效果。