一种自组装四臂型DNA荧光纳米探针及其构建方法和在温度检测中的应用与流程

本发明属于基因工程，尤其涉及一种自组装四臂型dna荧光纳米探针及其构建方法和在温度检测中的应用。

背景技术：

1、温度作为生命体最基本的参数，影响着活细胞内的每一个生化反应、酶活性、物质运输、细胞分裂和能量代谢。准确测量微小体系的温度，对从细胞水平认知生命过程具有重要意义，因此，开发纳米温度计具有重要价值。

2、十九世纪五十年代，j.d.watson和f.h.c.crick在nature上公开了dna双螺旋的结构模型，并暗示dna就是传承生命的遗传物质。1983年，seeman首次利用dna构建了核酸纳米结构，表明dna不仅承载了生命的重要遗传信息，而且还可作为构建纳米材料的元件，从而一门新兴科学——dna纳米技术产生了。dna纳米机器是其中发展最为迅速的方向之一，它是一种利用dna准确的碱基互补配对功能，在特定形式的能量驱动下通过改变碱基排列顺序进而可控地改变dna的构象，并做出某种机械运动实现能量转移的纳米装置。众所周知，dna包含a、t、c、g四种碱基种类，赋予了dna纳米机器结构多样性；同时由于dna碱基排列顺序可变、设计灵活，使其设计上具有可编程性；加之dna特有的碱基互补配对原则，使其具有高度地运动可控性。dna纳米机器可以像真正的开关一样捕获、保存和释放目标分子，实现“机器”的功能。目前，结构各异的dna纳米机器相继被构建并在许多方面，如药物运输、生物成像和生物传感等领域发挥重要作用，具有十分广阔的应用前景。

3、目前构建纳米机器的方法主要是设计多条线性dna序列，通过复杂的自组装方式形成dna纳米机器，且需要荧光基团标记，才能赋予纳米机器荧光性质。同时，报道的纳米机器大多应用于药物运输、成像、分子传感等单一领域。

4、综上所述，现有技术存在的问题是：

5、(1)目前报道的dna纳米机器构建方法复杂、序列要求高，限制了其广泛应用；

6、(2)目前文献报道的dna纳米机器的表征、示踪及成像等功能的实现所需的荧光信号需要对其dna骨架进行荧光基团标记，价格昂贵，限制了其广泛应用；

7、(3)dna纳米机器的功能较为单一，限制了其广泛应用，即dna纳米机器的应用范围有待扩宽；

8、(4)开发一种能响应温度变化的dna纳米机器有待解决。

9、解决上述技术问题的难度在于：

10、如何设计一种新型纳米机器，使得其序列设计容易、组装简单；如何设计一种新型荧光纳米机器，使得其荧光信号地获得无需荧光基团标记修饰，且荧光信号强度受目标物得调控；如何设计一种新型荧光纳米机器，使得其具有新型功能，比如温度响应。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的主要目的是构建一种无酶、免标记、免修饰的自组装四臂型dna荧光纳米探针。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种自组装四臂型dna荧光纳米探针，所述的纳米感应器包括dna自组装体和金属纳米簇，所述的dna自组装体由4条线性单链dna分子通过碱基配对自组装生成四臂型结构自组装体，第一条单链dna的序列如seq id no：1所示，第二条单链dna的序列如seq id no：2所示，第三条单链dna的序列如seq id no：3所示，第四条单链dna的序列如seq id no：4所示。

4、其中，自5'端起，第一条单链dna的第26、27位碱基为弯折处碱基，第二条单链dna的第27、28位碱基为弯折处碱基，第三条单链dna的第27、28位碱基为弯折处碱基，第四条单链dna的第27、28位碱基为弯折处碱基，从而形成四臂型结构自组装体。

5、进一步地，所述自组装四臂型dna荧光纳米探针中金属纳米簇位于seq id no：2的第1-15位碱基区域和seq id no：4的第38-52位碱基区域。

6、进一步地，所述自组装四臂型dna荧光纳米探针中的金属纳米簇为铜纳米簇。

7、第二方面，本发明提供了上述自组装四臂型dna荧光纳米探针的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

8、将四条单链dna分子在常温条件下孵育，自组装形成稳定的四臂型结构自组装体；

9、2)加入金属离子和还原剂，得到含有金属纳米簇的纳米探针。

10、其中，步骤1)中，孵育时间为30min，孵育温度为37℃。

11、步骤2)中，金属离子浓度为1mm，还原剂浓度为6mm。

12、进一步地，所述还原剂为抗坏血酸钠，所述金属离子为cu2+。

13、第三方面，本发明还提供了自组装四臂型dna荧光纳米探针在温度检测中的应用。

14、进一步地，自组装四臂型dna荧光纳米探针可检测的温度范围为40-80℃。

15、即本发明中，自组装四臂型dna荧光纳米感应器包括四个不同序列的线性结构dna(即四条单链dna分子)，并将合成金属纳米簇的模板dna单链序列理性设计进入线性结构dna中，使其能够通过碱基互补配对相互结合，形成四臂型dna结构，金属离子在还原剂的作用下，以此结构为模板，形成金属纳米簇，继而呈现荧光。

16、基于荧光dna纳米探针的温度响应应用，该应用是将构建成功的纳米感应器在不同温度下孵育，结果表明，四臂型dna荧光纳米探针在不同温度中呈现不同荧光强度，温度越高，四臂型dna荧光纳米探针荧光越弱；且温度与最大荧光强度在40-80℃范围内呈现显著的线性关系。

17、本发明与现有技术相比，具有以下优点：

18、(1)本发明首次设计了一种自组装四臂型dna纳米机器，即通过四条dna链的碱基互补配对，自组装形成四臂型dna纳米机器，方法简单、设计容易；

19、(2)本发明构建了一种四臂型荧光纳米探针，实现了荧光免标记，为功能化dna纳米机器的构建提供了新思路，为荧光成像技术提供了新工具；

20、(3)本发明首次将dna荧光纳米探针用于温度变化的响应，该纳米探针的应用比较新颖，为多功能纳米机器的构建提供了新思路，对于创新和发展多功能dna纳米机器具有重要科学意义。

技术特征：

1.一种自组装四臂型dna荧光纳米探针，其特征在于，所述的纳米探针包括dna自组装体和金属纳米簇，所述的dna自组装体由4条单链dna分子通过碱基配对自组装生成，其中，第一条单链dna的序列如seq id no：1所示，第二条单链dna的序列如seq id no：2所示，第三条单链dna的序列如seq id no：3所示，第四条单链dna的序列如seq id no：4所示。

2.根据权利要求1所述的自组装四臂型dna荧光纳米探针，其特征在于，所述的金属纳米簇位于seq id no：2的第1-15位碱基区域和seq id no：4的第38-52位碱基区域。

3.根据权利要求1所述的自组装四臂型dna荧光纳米探针，其特征在于，所述的金属纳米簇为铜纳米簇。

4.根据权利要求1所述的自组装四臂型dna荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述还原剂为抗坏血酸钠，所述金属离子为cu2+。

6.根据权利要求1-3任一所述的自组装四臂型dna荧光纳米探针在温度检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述对温度的检测范围为40-80℃。

技术总结本发明公开的一种自组装四臂型DNA荧光纳米探针及其构建方法和在温度检测中的应用，属于分子生物学中的基因工程领域，自组装四臂型DNA荧光纳米探针的4条单链DNA序列如序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。本发明提供的自组装四臂型DNA荧光纳米探针在不同温度环境中呈现不同荧光强度，且温度与最大荧光强度在40‑80℃之间呈现显著的线性关系。本发明利用基因工程技术，构建的无酶、免标记、免修饰的自组装四臂型DNA荧光纳米探针在环境温度检测和荧光成像中具有重要的实际应用价值。技术研发人员：吴正治,张鹏,姚永超,李利民受保护的技术使用者：深圳市第二人民医院（深圳市转化医学研究院）技术研发日：技术公布日：2024/12/2