第118位酪氨酸磷酸化MLC2抗体的制备方法和使用方法

本发明属于生物，具体涉及一种第118位酪氨酸磷酸化mlc2抗体的制备方法和使用方法。

背景技术：

1、磷酸化抗体是一种广泛应用于细胞信号转导领域的抗体，其可以特异性地识别蛋白质磷酸化修饰，并用于检测和研究不同的信号通路。

2、磷酸化抗原的制备需要先根据所关注的蛋白质确定其磷酸化位置，例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。磷酸化抗原可以通过重组蛋白合成多肽或天然蛋白质进行化学修饰而得到，其中最常见的方式为多肽合成；具体流程如下

3、1.根据所需的磷酸化位点确认多肽序列并设计引物

4、通过合成机制制备肽链，合成后需要进行质谱hplc等检测手段,确认合成多肽的结构和纯度，使用磷酸化酶将多肽在所需的位点磷酸化或者使用其他方法,如光化学或者人为合成等进行磷酸化修饰，最后对于磷酸化抗原的纯度和活性进行检测并保存；

5、磷酸化抗体的制备与传统的抗体制备类似都采用动物免疫技术制备抗体,具体步骤如下:

6、1.将磷酸化抗原注射到小鼠等动物体内,为了增强免疫效果可以将其混合佐剂或抗原疫苗进行免疫,经过多次诱导,小鼠身体内产生特异性抗体。

7、2.取出小鼠的脾脏制备脾细胞融合myloma细胞，经过细胞融合技术建立交流细胞库，筛选分离特异性的磷酸化抗体，经过上述抗体筛选过程获得特异性磷酸化抗体纯化和检测。

8、3.最后制备的磷酸化抗体可以保存在功能完备的条件下用于进一步的实验应用。

9、磷酸化抗体意义

10、1.磷酸化抗体可以用于检测蛋白质激酶的活性修饰，例如在磷酸化抗体的蛋白质免疫印迹实验中，可以通过比较非磷酸化的抗体和磷酸化抗体对同一蛋白的识别，来体现蛋白质激酶的活性。

11、2.磷酸化抗体可以用于检测信号通路激活的状态，例如在蛋白质芯片实验中可以上载磷酸化抗体检测蛋白质的磷酸化，通过这些研究可以全面了解蛋白质磷酸化与其参与的信号通路之间的关系，通过这些研究，可以全面了解蛋白质磷酸化预期参与的信号通路之间的关系。

12、3.磷酸化抗体可以用于细胞调亡的研究例如用于紫杉醇等化合物的对于细胞凋亡的引发程度等。

13、磷酸化抗体的细胞信号转导是一种功能强大，应用广泛的工具，是值得生物科研工作者深耕的领域。其制备需要多次免疫和严格的筛选过程，可以用于各种单向或双向转导通路的研究，为细胞信号转导研究提供十分重要的实验手段。目前来看，如何获得磷酸化特异性更高，亲和力更好的抗体是提高检出能力和质量的最佳途径。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种磷酸化特异性高，亲和力高的第118位酪氨酸磷酸化mlc2抗体的制备方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种第118位酪氨酸磷酸化mlc2抗体的制备方法，包括抗原的制备、免疫、亲和层析柱的制备以及抗体的制备，所述第118位酪氨酸磷酸化mlc2抗体用于细胞免疫荧光和免疫组化实验，其特征在于，利用abdesigner软件对mlc2蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，分析内容包括亲水性、抗原性、表面可能性和柔性区在内的多个指数的评估，同时考虑包括氨基酸结构复杂程度，易氧化程度，合成难度，氨基酸类别和分布在内的多个因素，先确定mlc2的序列为kraggans(p)nvfsm；为保证后期多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在多肽链c末端增加一个半胱氨酸c，使多肽通过半胱氨酸与klh偶联，最终确定mlc2抗原表位多肽序列为kraggans(p)nvfsmc；

3、所述第118位酪氨酸磷酸化mlc2抗体的制备方法中，免疫部分至少包括如下步骤：

4、a.免疫方法

5、a1.基础免疫：将需免疫的羊从笼子中抓出放在操作台上，皮下注射8－10个部位，每个部位注射0.3－0.5ml乳化合格的抗原；

6、a2.加强免疫:除背部皮下免疫5个点外，增加注射两个肌肉位点，每个部位注射0.1－0.3ml抗原；

7、a3.血清收集:采集两次检测用血，第一次加强免疫后第七天采集检测血a，第二次加强免疫后七天采集检测血b；第三次加强免疫后七天采集阳性血后留样作为检测血清；

8、a4.将收集的检测血a和检测血b离心后分离血清。

9、所述抗原的制备包括如下步骤：

10、b.多肽偶联

11、b1.在klh溶液中加入sulfo-smcc，得到klh-smcc溶液，将klh-smcc溶液用脱盐柱去除游离的sulfo-smcc；脱盐柱用不少于3个柱体积的交联缓冲液平衡，然后上样；待klh-smcc溶液进入胶床后，用交联缓冲液洗脱；通过测定280nm的光吸收值收集klh-smcc所在的蛋白峰液并收集此峰液；合并每次峰收液；

12、b2.用lowry法测定收集klh-smcc的浓度，根据所测蛋白浓度将klh-smcc按3mg/管分装；

13、b3.加入20mg/ml的多肽溶液反应不少于6小时，再加入l-半胱氨酸溶液反应数小时；

14、b4.将混合液转移至新处理好的透析袋中，用pbs缓冲液透析，透析完成后收集透析袋中全部内容物，并用38℃-45℃的pbs缓冲液加压冲洗透析袋，收集全部冲洗液；

15、b5.将多肽-klh偶联物稀释为1mg/ml并分装，得到多肽-klh抗原，低温保存。

16、所述a1中乳化合格的抗原的制备方法为：

17、c.抗原乳化

18、c1.免疫前应根据计划安排，提前准备好抗原乳化所需双联注射器和免疫用玻璃注射器，并贴好标签；

19、c2.免疫当天根据计划安排，取出多肽-klh抗原和相应的福氏佐剂；

20、c3.用0.01mpbs将抗原稀释到1ml/羊；

21、c4.将全部抗原吸入一支乳化用注射器，另一支注射器吸入与抗原液等体积的福氏佐剂，要把注射器中的气体驱除干净，用双联针头将两只注射器连接起来，用力将抗原液快速推入佐剂内，然后反复推拉双联注射器，直至乳化完成；将经检验乳化合格的抗原通过双联针头转到注射用玻璃注射器中，安上针头待用。

22、所述亲和层析柱的制备包括如下步骤：

23、d.亲和层析柱的制备

24、d1.多肽与sulfolink gel偶联：从4℃冰箱中取出sulfolink gel，放置使其达到室温；竖直放好柱子，打开顶盖；一个柱体积交联缓冲液清洗柱子，留少量交联缓冲液于柱子底部，装上底部disc胶固定片；

25、d2.取sulfolink gel混匀好的悬浮液装入层析柱，至少用20ml交联缓冲液平衡，然后装上层析柱底盖；

26、d3.将溶解好的2mg多肽稀释到2ml交联缓冲液中；

27、d4.将多肽溶液加入层析柱，层析柱采用sulfolink gel层析柱，在4℃下摇动混匀层析柱反应过夜，次日取层析柱在室温静置数十分钟，按先上后下顺序取下层析柱顶盖与底盖，让层析柱中的反应后的多肽溶液排出并收集；

28、d5.封闭sulfolink gel上非特异性位点：重新打开层析柱底盖，取2ml50mm l-半胱氨酸溶液加入柱中与胶反应，装上层析柱顶盖，室温混匀反应数小时；室温静置数十分钟，放出多余的l-半胱氨酸溶液；

29、d6.洗柱：按先上后下顺序取下层析柱顶盖与底盖，排出层析柱中的液体，用pbs洗涤层析柱，第一遍时把层析柱上部的disc胶固定片装上，然后分别用1mol/l nacl溶液，pbs缓冲液，gly-hcl缓冲液清洗层析柱，得到亲和层析柱；

30、d7.亲和层析柱的储存：重新装上底盖，向层析柱中加入储存液10ml，使其流出至上层液面与disc胶固定面相距0.8±0.2cm，然后重新装上顶盖，得到亲和层析柱。

31、所述抗体的制备包括如下步骤：

32、e.血清处理:取出待处理的各批次血清，混合后，按血清量，加入1/10体积的1mol/l tris ph7.5缓冲液调ph值，在室温下混匀静置一段时间后用除菌膜过滤；

33、f.偶联了磷酸化多肽的p肽柱层析；

34、f1.从4℃冰箱取出交联好的偶联了磷酸化多肽的亲和层析柱，放置至室温，先取下顶盖，避免空气进入胶床；

35、f2.取下底盖，让多余的储存缓冲液流出；用10mm pbs ph7.420ml清洗层析柱；

36、f3.从柱中取出p肽偶联的sulfolink gel 2ml，与处理后的血清样品混合，将混合样品在静音旋转仪上旋转混匀，在4℃条件下混匀反应过夜或在室温下混匀反应2小时；

37、f4.空层析柱直立放置于层析架上，加入10mlpbs用洗耳球吸吹以除去层析柱底片及底片下面的空气；将血清-sulfolink gel混合溶液分步装入层析柱，sulfolink gel沉积形成胶床，用pbs 5－7ml清洗层析柱，洗出胶内所含血清，收集流出液；

38、f5.用20ml 10mm pbs清洗层析柱，pbs的ph7.4，在液面距离胶面还有1－2cm时塞上层析柱的底盖，把胶上面disc胶片装上，再用10ml pbs ph7.4清洗层析柱，最后用10mmpbs ph7.4含0.05％tween20溶液20ml清洗层析柱；

39、f6.每个样品准备2个含100ul 1m tris·hcl ph7.5的1.5ml收集管及一个30ml的瓶子，做好标记；

40、f7.先用100mm甘氨酸缓冲液ph3.01ml洗层析柱，不收集洗脱液，再用100mm甘氨酸缓冲液ph3.01ml洗层析柱两次，每次流出液收集于1个1.5ml离心管中，混匀使其ph恢复中性，再根据蛋白多少决定是用瓶子接还是用比色杯接，直至收集至无蛋白为止；

41、f8.将各管收集液于280nm处比色，光吸收超过0.1的合并入洗脱液用于下一步纯化；

42、f9.p肽层析过的血清流出液，按f1-f8步骤重复吸收，直到抗体吸收完全为止；

43、f10.样品如果浓度过高产生沉淀则要先离心除去沉淀；测定最终洗脱液的吸光值；

44、f11.纯化过血清留样用于elisa检测。

45、所述c2中，基础免疫使用完全福氏佐剂，加强免疫使用不完全福氏佐剂。

46、所述c4中，转移前须核对乳化用注射器和注射用注射器及针头标签号是否一致。

47、所述klh-smcc溶液按照klh 100mg：水12.5ml：sulfo-smcc 25mg来配制。

48、c3中，每次每只羊采集0.3－0.4ml全血。

49、一种第118位酪氨酸磷酸化mlc2抗体的使用方法，其特征在于，采用elsia法检测该抗体的磷酸化特异性，分别用磷酸化mlc2 tyr118多肽和非磷酸化mlc2多肽包被后进行识别比较。

50、本发明的第118位酪氨酸磷酸化mlc2抗体的制备方法，适合规模化产出第118位酪氨酸磷酸化mlc2抗体，该抗体能识别mlc2第118位酪氨酸被磷酸化的状态，不识别非磷酸化状态，具备磷酸化特异性高，亲和力好的特点。