一种鉴定番茄种子颜色的SNP位点、KASP标记引物组及其应用

本技术要求优先权，在先申请的申请号为202311366874.4(一种鉴定番茄种子颜色的snp位点、kasp标记引物组及其应用)。本发明属于生物，具体公开了一种鉴定番茄种子颜色的snp位点、kasp标记引物组及其应用。

背景技术：

1、番茄具有较高的营养价值和经济价值，是重要的鲜食产品和加工原料，已成为继玉米、水稻、小麦与马铃薯等之后的世界第七大作物，全球年工业产值可达500亿美元。杂交种具有丰产、优质和抗病等诸多杂种优势，在快速聚合优良基因和性状的同时，还能够有效保护育种者的知识产权，因此，目前番茄的生产多以一代杂交种为主。

2、番茄杂交种子生产的问题：普通番茄的种子及杂交制种生产的种子多为灰黄色。杂交制种主要是通过人工去雄和人工授粉的方式进行。杂交种的生产是一个劳动密集型产业，且生产周期长，生产成本高。番茄杂交种子生产后，目前的鉴定方法是抽样后，需要种植植株或育苗提取dna后分子标记检测，耗费周期较长。出现纯度达不到销售要求的种子只能报废或者销毁，给种子生产者造成较大损失，同时严重挫伤杂交制种生产的积极性，在当前劳动力不足特别是番茄杂交制种熟练工严重匮乏的情况下，不利于番茄杂交制种的可持续发展；同时，由于番茄杂交制种成本的逐年高涨，出现种子纯度不够的情况，也给种子繁育单位品种的推广带来很大不利影响，甚至影响番茄新种源的推广和改良。

3、番茄杂交制种种子纯度的鉴定方法：番茄杂交种生产后的纯度鉴定方法主要有表型标记鉴定和分子标记鉴定等方法。其中表型鉴定法主要通过幼苗绿茎、植株生长特性以及果实的颜色和形状等标志·性表型进行鉴定。分子标记鉴定主要通过筛选父母本之间差异性的分子标记，从而对杂交种子进行鉴定，如果标记量不够，则不能保证种子遗传背景的筛选，无法保证该杂交种的纯度；如果标记数量足够大，则增加了检测成本和时间。以上方法都只能对生产的种子纯度进行鉴定，但都不能将假杂种挑选出来，对不能达到纯度标准和要求的种子只能报废处理，从而造成较大的经济损失。

4、利用花粉直感效应进行杂交种纯度鉴定的方法：在作物杂交育种中有一种叫做直感的现象。所谓直感现象，是指杂交授粉后，父本花粉使母本所结杂交种子的胚以外组织直接表现父本性状的现象，或称当代显性，英文名称是xenia，可分为种子直感和果实直感。其中种子直感又称胚乳直感，指杂交种子的胚乳(或子叶)组织直接表现父本同种组织的显性性状的现象。因杂交种子虽然长在母本植株上，但其胚和胚乳却是两个雄核分别与雌配子的卵核和两个极核受精结合的产物，都属于子代(f1)的组织。所以父本的显性胚乳性状必然要在杂交种子上表现出来；而显性的植株性状则必须等杂交种子播种后，由胚所长出的植株从幼苗到成株的发育过程中才能依次表现。

5、由于父本的显性胚乳性状在杂交当代就由母本植株所结的种子上表现，故称种子直感。如玉米的黄胚乳基因(y)为白胚乳基因(y)的显性，以白胚乳子粒的玉米自交系(yy)为母本，授以父本黄粒玉米自交系(yy)的花粉，则可在白粒玉米自交系的果穗上结出黄胚乳(yyy)的子粒。直感现象对认识植物的受精过程、鉴别杂交种子的真伪和生产上利用表现直感现象的经济性状等，都具有一定意义。

6、综上所述：番茄杂交制种过程中种子纯度是保障番茄新品种繁育推广的一个关键问题，关于番茄杂交种子纯度的检验方法较多，但均无法将纯度不合格的种子的纯度提升。因此，亟需开发出一种在不损伤种子的前提下，能够将假杂种挑选出来，从而提升种子纯度的方法，以及在生产番茄杂交种时，能达到机械化分选真杂种与假杂种的目的。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明公开了一种鉴定番茄种子颜色的snp位点、kasp标记引物组及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

2、为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

3、一种鉴定番茄种子颜色的snp位点，其特征在于，所述snp位点位于seq id no：1第501bp处，多态性为t/c。

4、进一步的，上述一种鉴定番茄种子颜色的snp位点，当snp位点的碱基为t时，该番茄种子颜色为灰黄色；当碱基为c时，该番茄种子颜色为深褐色。

5、本发明还公开了一组kasp分子标记引物组，针对上述snp位点；包括f1引物如seqid no：2所示，f2引物如seq id no：3所示，c引物如seq id no：4所示。

6、进一步的，上述kasp分子标记引物组，所述f1引物5’端带有荧光修饰基团fam，所述f2引物5’端带有荧光修饰基团hex。

7、本发明还公开了上述snp位点或kasp分子标记引物组，在下列(1)～(5)中的任一项应用：

8、(1)快速鉴定或辅助鉴定番茄种子颜色；

9、(2)番茄育种；

10、(3)制备鉴定或辅助鉴定番茄种子颜色为深褐色的单株；

11、(4)番茄杂交制种；

12、(5)番茄杂交制种中种子纯度的鉴定与提升。

13、进一步的，上述应用中，番茄深褐色种子的株系自交后种子为深褐色，而深褐色种子株系做母本与正常野生型灰黄色种子株系杂交后的种子为灰黄色，呈当代显性特征。

14、进一步的，上述应用中，深褐色种子的番茄可用于种子杂交繁殖后杂交种纯度的鉴定、假杂种的筛除以及杂交种纯度的提升。

15、进一步的，上述应用中，所述应用包括以下步骤：

16、a.番茄基因组dna样本的提取；

17、b.采用seq id no：2-4所示的引物对番茄基因组dna进行pcr扩增，得到扩增产物：

18、c.使用酶标仪读取荧光信号，然后使用软件解析转换荧光信号，得到清晰直观的分型图，并根据颜色不同，输出基因型结果，预测番茄种子颜色。

19、进一步的，上述应用中，所述步骤c中，褐色种子显示绿色荧光信号，纯合基因灰黄色种子显示蓝色荧光信号，杂合基因型灰黄色种子显示红色荧光信号。

20、本发明具有以下有益效果：

21、1.本发明揭示了番茄深褐色种子的花粉直感效应及当代显性特征，为番茄杂交种子的纯度鉴定和纯度筛选与提升提供了材料基础。

22、2.本发明筛选出与番茄深褐色种子连锁的snp位点，并公开了kasp标记引物组，采用本发明成套引物对番茄育种群体进行辅助选择得到了种子为深褐色的番茄株系，这表明本发明所述分子标记物用于番茄种子颜色性状的分子标记辅助选择是切实有效的，利用本发明进行分子标记辅助选择可提高选择效率，加快育种进程。

23、3.用此方法鉴别番茄种子是否具有深褐色颜色性状，不需要等果实成熟，只需通过简单的dna提取、pcr特异性扩增、kasp基因分型检测即可完成对样品的鉴别。本方法不需要限制性内切酶酶切，标记的特异性强、稳定性高，并且标记的筛选方法操作简便快捷具有试验试剂用量少，速度快，成本低，适合大批次、高通量、自动化的优点，非常适合现代农业分子育种的实现。

24、4.用此方法鉴别出的深褐色种子的番茄株系可用于番茄杂交制种中种子纯度的鉴定和提升。利用深褐色种子的番茄株系做母本与普通灰黄色种子的番茄株系杂交，授粉后所生产的杂交种为灰黄色，而没有能够授粉的番茄种子则呈深褐色，可以通过人工挑选或种子色选仪等方法，将未能授粉的深褐色种子挑选出来，从而提高所生产种子的纯度。特别是对于所生产的纯度不达标的种子，可以大大降低种子生产者的损失，能够有效保障番茄的制种产量和种子纯度。