一种抗逆的大肠杆菌及其构建方法与在丁二酸生产中的应用

本发明属于基因工程和生物工程，具体涉及一种抗逆的大肠杆菌及其构建方法与在丁二酸生产中的应用。

背景技术：

1、丁二酸(succinic acid)又称琥珀酸，是一种重要的有机化工原料，广泛应用于生物高分子、食品与医药等行业；同时，作为一种优秀的c4平台化合物，它是合成许多重要商业化学品的关键中间体，如己二酸、1,4-丁二醇、四氢呋喃、n-甲基吡咯烷酮、2-吡咯烷酮和γ-丁内酯，被认为是未来12种最具发展前景的生物炼制产品之一。

2、传统工业中主要利用石油基产品为原料通过化学法合成丁二酸，但这种方法具有高价格和高污染等局限性。利用微生物发酵法生产丁二酸具有可再生、环境友好、价格低廉等优势，逐渐成为国内外学者研究的热点，生物基丁二酸在石油基大宗化学品市场中也越来越受到关注。优良菌种的选择是应用微生物发酵法制备丁二酸的关键，它将会直接影响到丁二酸的收率，进而影响到其后续的分离纯化。厌氧发酵具有高收率的特点，因此，被广泛用于丁二酸的生产中。目前丁二酸的厌氧生产菌株主要集中在产琥珀酸放线杆菌(actinobacillus succinogenes)、产琥珀酸厌氧螺菌(anaerobiospirillumsucciniciproducens)、产琥珀酸曼氏杆菌(mannheimia succiniciproducens)和重组大肠杆菌(escherichia coli)上。大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛应用于丁二酸的生产中。

3、大肠杆菌虽然是优良的丁二酸生产宿主，但是高浓度的丁二酸会使发酵液偏离其最适生长ph(ph约为7.0)。一旦游离酸进入细胞质，释放的质子会造成dna损伤和酶变性，积累的共轭碱也会扰乱细胞的阴离子平衡。因此，在丁二酸发酵过程中往往需要添加ph中和剂。然而，碱性中和剂的加入虽然可以使ph维持稳定，但是渗透压和生产成本的增加仍然阻碍了丁二酸的大规模生产。在当前的研究背景下，如何提高大肠杆菌对低ph和高渗透压的抗逆性能，显得尤为重要。

4、生物被膜是细菌为了更好的应对外部环境变化，自发地在一些生物或非生物表面聚集的现象；同时，分泌出胞外多糖、蛋白质和核酸等物质，然后将菌体包裹缠绕从而产生的一种膜状物。生物被膜是细菌为应对外界环境压力而产生的一种自我防御结构，它有助于提升细菌对环境波动的适应力，并增强菌株对外界环境的抵抗力。淀粉样纤维是一种纤维性蛋白质，其中curli是一种典型的功能淀粉样纤维，它参与大肠杆菌生物被膜的形成。csga基因是淀粉样纤维的主要亚基，在curli的形成中起到关键作用。胞外多糖是生物被膜中的主要成分，铜绿假单胞菌生物被膜中胞外多糖psl的合成与基因簇psl(a-j)有关。目前，将csga基因和psl(a-j)基因簇同时应用于增强大肠杆菌生物被膜形成并提高其发酵性能的相关报道还未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种抗逆的大肠杆菌及其构建方法与在丁二酸生产中的应用，菌株的构建方法简单方便，构建得到的菌株发酵简单可行，对高渗透压、低ph具有较强的抗逆性能，可以进一步提高丁二酸的产量，从而降低生产成本，提高经济效益。

2、为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案。

3、一种抗逆的大肠杆菌，以在厌氧条件下发酵生产丁二酸的大肠杆菌为出发菌株，构建过量表达大肠杆菌csga基因和异源表达psl(a-j)基因簇的重组大肠杆菌得到。

4、所述csga来源于大肠杆菌e.coli ber208，其核苷酸序列如seq id no.1所示；

5、所述的psl(a-j)基因簇来源于铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa pa01，其核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、优选的，所述出发菌株选用e.coli ber208，保藏编号为cctccno：m2012351。

7、所述重组大肠杆菌的构建方法，采用如下步骤实现：

8、(1)大肠杆菌csga基因和psl(a-j)基因簇克隆到pdonor质粒上，得到重组质粒；

9、(2)将重组质粒pdonor-csga-psl(a-j)转化入出发菌株中，即得到重组大肠杆菌。

10、具体的，上述(1)中重组质粒采用如下方式构建：

11、(1)以大肠杆菌基因组为模板，利用pcr扩增体系扩增csga基因片段，pcr产物片段回收；以铜绿假单胞菌基因组为模板，扩增psl(a-j)基因簇，pcr产物片段回收；

12、(2)利用反向pcr扩增体系扩增pdonor质粒，pcr产物经电泳后回收；再利用t4连接体系，将前述经pcr回收的质粒和基因片段连接；

13、(3)将重组质粒利用cacl2转化法转化至e.coli dh5α感受态中，挑取阳性克隆做菌落pcr验证，将正确的阳性克隆培养后提取重组质粒并测序。

14、(4)将重组质粒利用cacl2转化法转化至e.coli ber208感受态中，挑取阳性克隆做菌落pcr验证，将正确的阳性克隆培养后于-80℃保藏。

15、大肠杆菌ber208导入pdonor-csga-psl(a-j)质粒，过量表达csga基因和异源表达psl(a-j)基因簇，得到的重组大肠杆菌抗逆性显著提高，生物被膜形成量远高于原始菌株，其能够耐受高渗透压、低ph条件。

16、本发明一个实施例中利用了一种结晶紫染色法定量测定生物被膜形成量的方法，经过测定，重组大肠杆菌生物被膜形成量相较于出发菌株提高66.18％。

17、本发明的另一目的在于提供上述方法构建的重组菌株在丁二酸生产中的应用。

18、所述应用具体为：

19、(1)将保存于-80℃冻存管中的重组大肠杆菌平板划线，过夜培养12h；

20、(2)将上述菌株接种到lb液体培养基试管中，在37℃摇床中培养12h；

21、(3)以1～10％v/v接种量接种到新鲜的lb液体培养基的三角瓶中，37℃、180rpm摇床培养12～18h；

22、(4)重组大肠杆菌活化培养后，以5～15％v/v接种量接种到发酵培养基中，初始葡萄糖浓度为40～60g/l，初始ph调节为6.8，35～39℃厌氧发酵，当od长至0.6～1.0左右时，加入2g/l阿拉伯糖进行诱导，当葡萄糖消耗至0～10g/l以下时，将葡萄糖浓度补至30～40g/l，转速60～240rpm，发酵时间为72～120h。

23、所述发酵培养基中其他组分为：0.12g/l甜菜碱、2.6g/l(nh4)2hpo4、0.87g/lnh4h2po4、0.15g/l kcl、0.37g/l mgso4·7h2o、2.4g/l fecl3·6h2o、0.1g/l h3bo3、0.3g/lcocl2·6h2o、0.15g/l cucl2·2h2o、0.5g/l zncl2·4h2o、0.5g/l namoo4·2h2o、0.5g/lmncl2·4h2o，溶剂为水。

24、优选的，所述发酵培养条件为：37℃发酵120h，转速90rpm。

25、优选的，所述种子培养的过程为：将活化后的菌种以2％的接种量转接到lb培养基中，37℃、180rpm活化12h。

26、本发明采用厌氧瓶或发酵罐一步厌氧发酵重组大肠杆菌生产丁二酸。

27、重组大肠杆菌进行厌氧瓶发酵性能(高渗透压)验证，出发菌株做空白对照，具体步骤为：

28、(1)不同初始丁二酸钠添加量条件下的厌氧瓶发酵：

29、重组大肠杆菌活化培养后，转入厌氧瓶发酵，厌氧瓶添加0、20、40、60g/l丁二酸钠四个浓度梯度，转速90rpm，发酵时间为72h进行同批次发酵，每个条件做三个平行实验，出发菌株做空白对照；

30、(2)不同初始乙酸钠添加量条件下的厌氧瓶发酵：

31、重组大肠杆菌活化培养后，转入厌氧瓶发酵，厌氧瓶添加0、2.5、5、7.5、10g/l乙酸钠五个浓度梯度，转速90rpm，发酵时间为72h进行同批次发酵，每个条件做三个平行实验，出发菌株做空白对照。

32、重组大肠杆菌生产丁二酸的应用，在5l发酵罐放大实验，具体步骤为：

33、(1)使用lb固体平板划线，过夜培养至出现较大的单菌落，然后进行种子活化培养；

34、(2)将活化的种子以10％v/v接种量接入装有2.5l发酵培养基的5l发酵罐中，初始葡萄糖浓度为50g/l，ph分别维持5.5～6.8，转速90rpm，37℃厌氧发酵，当od长至0.6左右时，加入2g/l阿拉伯糖进行诱导；当葡萄糖消耗至10g/l以下时，将葡萄糖浓度补至40g/l，发酵时间为72～120h。

35、结果表明，本发明构建得到的重组大肠杆菌对高浓度产物、高浓度副产物以及较低ph的抗逆性能明显提高，在厌氧发酵过程中，重组大肠杆菌的丁二酸生产能力明显增强。

36、有益效果：

37、本发明通过过量表达来自于大肠杆菌的csga基因和异源表达来自于铜绿假单胞菌的psl(a-j)基因簇，构建了一种生物被膜形成能力增强的产丁二酸大肠杆菌，该重组大肠杆菌的抗逆性能明显增强；通过厌氧瓶发酵及5l发酵罐放大实验可知，该重组大肠杆菌对高浓度产物、高浓度副产物以及较低ph的抗逆性能明显提高，在厌氧发酵过程中，重组大肠杆菌的丁二酸生产能力明显增强。本发明的方法显著提高了大肠杆菌在丁二酸生产过程中的抗逆性能，有利于大肠杆菌丁二酸发酵的工业化应用。