获得高纯度NK细胞的方法与流程

本发明涉及生物医药领域，特别涉及获得高纯度nk细胞的方法。

背景技术：

1、自然杀伤细胞(natural killer cell，nk细胞)，是除t细胞和b细胞之外的第三大类淋巴细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，甚至参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，nk约占血液中所有免疫细胞(白细胞数量)的15％，属于天然免疫系统的核心细胞，主要分布于外周血、肝脏和脾脏。nk细胞作为一种重要的先天性免疫效应细胞，是机体抗肿瘤的第一道防线，是体内负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞的最主要“战士”。nk细胞与人体其他150多种白细胞都不同，它不需要接受免疫系统的特殊指令，也不需要其他细胞的配合，自己单独就能识别和攻击外来细胞、癌细胞和病毒。循环的nk细胞通常处于休眠状态，一旦被激活，它们会渗透到组织中，分泌穿孔素及肿瘤坏死因子，攻击肿瘤细胞和病毒感染细胞。

2、目前nk细胞的抗肿瘤效果在多种血液病恶性肿瘤的临床治疗中已获得了良好的治疗效果。如何有效的获得nk细胞并且快速扩增是利用nk细胞进行细胞治疗的关键。目前用于nk细胞治疗的细胞主要来源于自体分离的nk细胞，基于辅助细胞或饲养细胞的扩增方法可产生较高nk细胞数量，基于细胞因子的扩增方法最常用的细胞因子是4-1bbl、il12、il15、il18、il21和il27在体外通过固化或偶联到磁珠(磁珠法)完成nk细胞的扩增，但采用传统方法扩增nk细胞的效率较低，不同nk细胞扩增所需的细胞因子的种类和有效浓度批间差异大，并过程复杂化需要大量的质量控制，批次间的差异较大，同时在收集细胞过程中残留的磁珠无法完全去除，在临床应用中存在较大的安全隐患。

3、因此，本领域亟需开发新的扩增nk细胞的方法，以解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种核酸序列组合。

2、本发明的另一目的在于提供一种载体。

3、本发明的另一目的在于提供一种宿主细胞。

4、本发明的另一目的在于提供一种获得高纯度nk细胞的方法。

5、为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供了一种核酸序列组合，所述核酸序列组合包括第一核酸序列、第二核酸序列以及第三核酸序列；

6、其中，所述第一核酸序列包括编码cd137l的核酸序列；

7、所述第二核酸序列包括编码il12b (nksf2)的核酸序列；

8、所述第三核酸序列包括编码il21的核酸序列。

9、在一些优选的方案中，所述第一核酸序列为编码cd137l的核酸序列。

10、在一些优选的方案中，所述第一核酸序列为编码cd137l的核酸序列，其中，所述编码cd137l的核酸序列由胞内片段序列、跨膜区序列以及胞外段序列组成。

11、在一些优选的方案中，所述第二核酸序列包括编码il12b (nksf2)的核酸序列、编码linker得核酸序列以及编码跨膜区的核酸序列。更优选地，所述第二核酸序列由依次连接的编码il12b (nksf2)的核酸序列、编码linker的核酸序列以及编码跨膜区的核酸序列组成。

12、在一些优选的方案中，所述第三核酸序列包括编码il21的核酸序列、编码linker得核酸序列以及编码跨膜区的核酸序列。更优选地，所述第二核酸序列由依次连接的编码il21的核酸序列、编码linker的核酸序列以及编码跨膜区的核酸序列组成。

13、在一些优选的方案中，所述第二核酸序列和所述第三核酸序列中，编码linker的核酸序列相同或不同。

14、在一些优选的方案中，所述第一核酸序列如seq id no.3所示。

15、在一些优选的方案中，所述第二核酸序列如seq id no.1所示。

16、在一些优选的方案中，所述第三核酸序列如seq id no.5所示。

17、本发明的第二方面，提供了一种载体组合，所述载体组合包括第一载体、第二载体以及第三载体；所述第一载体包括所述第一核酸序列，所述第二载体包括所述第二核酸序列，所述第三载体包括所述第三核酸序列。

18、在一些优选的方案中，所述载体为质粒，更优选地为pires-puro3。

19、本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面所述的载体组合。

20、在一些优选的方案中，所述宿主细胞为raji细胞。

21、在一些优选的方案中，所述宿主细胞高表达超级nk细胞的标志物。

22、在一些优选的方案中，所述宿主细胞高表达ncam1+(cd56)和fcgr3a(cd16)中至少一种标志物。

23、在一些优选的方案中，所述宿主细胞高表达ncam1+(cd56)、fcgr3a(cd16)、top2a和mki67中至少一种标志物。

24、在一些优选的方案中，所述宿主细胞高表达ncami+(cd56)和fcgr3a(cd16)。

25、在一些优选的方案中，所述宿主细胞高表达ncam1+(cd56)、fcgr3a(cd16)、top2a和mki67。

26、在一些优选的方案中，通过电转染的方式使得本发明第二方面所述的载体组合共转染至raji细胞，得到所述宿主细胞。

27、在一些优选的方案中，所述载体组合中，第一载体、第二载体和第三载体的比例为1：1：1。

28、本发明的第四方面，提供了一种获得高纯度nk细胞的方法，所述方法包括步骤：

29、s1：构建cd137l、il12b和il21的raji稳转细胞株；

30、s2：使s1所得细胞株充分破碎，并提取细胞膜；

31、s3：使用s2所得细胞膜处理外周血单核细胞，然后培养所述单核细胞，即得。

32、在一些优选的方案中，所述构建cd137l、il12b和il21的raji稳转细胞株包括步骤：

33、s11：将本发明第二方面所述的载体组合共转染至raji细胞；

34、s12：培养s1所得细胞以构建稳定表达cd137l、il12b和il21的raji细胞池，通过有限稀释法对所述raji细胞池进行克隆化，从而得到单克隆细胞；

35、s13：通过流式分选法富集cd137l、il12b和il21高表达的单克隆细胞，从而得到稳转细胞株。

36、在一些优选的方案中，s3中，连续培养所述细胞14天，所述方法所得nk细胞的cd56+和cd16+阳性率不低于90％，优选地不低于91％，优选地不低于92％，优选地不低于95％。

37、本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优势：

38、(1)本发明建立了一套超级nk细胞的快速高效扩增方法，使用该方法可以得到cd56+和cd16+阳性率不低于90％的nk细胞，所得nk细胞高表达超级nk细胞的标志物，且具有高活性。

39、(2)本发明还提供了表征nk细胞培养后的单细胞亚群分析的方法，通过单细胞技术分析细胞治疗产品的细胞亚型及状态，对临床上治疗方式选择、治疗监测及应答情况、生存预后等方面验证都可以提供相当多的数据支撑。

40、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。