一种针对沙滩样本的总DNA提取方法与流程

本发明属于分子生物学，具体涉及一种针对沙滩样本的总dna提取方法。

背景技术：

1、在沙滩dna提取方法的背景技术方面，存在一些挑战和研究进展。首先，沙滩生态系统对环境变化极为敏感，能够反映出人类活动和气候变化对生物多样性的影响。因此，沙滩生物多样性的检测对于理解物种多样性、时空动态和威胁因素至关重要，并且可以为生物多样性及重要生物资源的保护管理和有效利用提供科技支撑。

2、然而，从沙滩沙子中提取dna存在一定的难题。沙子中微生物dna的提取受到诸如腐殖酸等物质的干扰，这些物质与dna在分子大小和理化性质方面相近，能够阻碍dna的提取和分离。为了获得高质量、高纯度的dna，研究人员尝试了多种方法，包括物理方法如液氮研磨、超声波处理，以及化学方法如使用ctab和蛋白酶k去除杂质。此外，研究人员还探索了使用环境dna宏条形码技术进行物种多样性分析的方法(专利公开号cn118147272a)。但是在海洋沉积物中，总dna的提取方法研究进展表明，不同的提取方法可能因材料来源和环境组成成分的不同而有所差异。例如，张宁等人在对动物、植物、微生物以及海洋生物dna提取进展的比较中发现，不同来源的实验材料因其组织和细胞结构特点不同，往往采用不同的dna提取方法。目前环境dna提取方法大多来源于水体、土壤和沉积物。沙滩环境相对于这些环境其dna更不容易附着，使用海洋动物组织dna提取试剂盒和土壤样品dna提取试剂盒所(专利公开号cn102206630a)获得dna产量低，很难用于物种鉴定、基因组测序以及环境dna宏条形码技术。综上所述，沙滩dna提取方法的对沙滩生物多样性调查、海洋污染检测、保护公共健康和支持海滩旅游经济都有重要价值。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种针对沙滩样本的高效总dna提取方法。该方法结合多种优化步骤和特定试剂，实现了对沙滩样本中高质量、高产量且无污染的总dna的提取。

2、本发明的目的是提供一种针对沙滩样本的总dna提取方法，包括如下步骤：

3、s1.采用5ml容器管采集沙滩样本至4ml；

4、s2.加入1ml抽提缓冲溶液在200rpm的条件下旋转震荡30min；本步骤使用旋转振荡器释放环境dna，无需裂解介质玻璃珠、纯锆珠等研磨；

5、s3.加入200μl裂解液混匀，90℃加热10min，期间颠倒混匀一次；加热结束后静置5min，将液体转移至离心管；

6、s4.加入300μl沉淀液，充分混匀后冰浴5min，再次充分颠倒混匀；

7、s5.14,000×g离心5min，吸取上清液转移至新的离心管，并加入800μl 6mol/l盐酸胍、400μl无水乙醇，混匀后静置3min；

8、s6.将步骤s5所得混合溶液分批次加入吸附柱中，静置30s后10000×g离心1min，弃去滤液，重复本步骤至步骤s5所得混合溶液全部转移至吸附柱中；

9、s7.加入750μl洗脱液至吸附柱中，静置30s后10,000×g离心1min，弃去滤液；

10、s8.加入750μl漂洗液至吸附柱中，静置30s后10,000×g离心1min，弃去滤液；

11、s9.14,000×g离心空的吸附柱3min，弃去离心管；

12、s10.更换新的离心管作为收集管，加入100μl ddh2o，55℃静置5min；

13、s11.14,000×g离心2min，回收收集管中的dna。

14、优选，所述的提缓冲溶液组成如下：100mmol/l ph8.0的tris-hcl、100mmol/lph8.0的edta-na2、100mmol/l磷酸钠缓冲液、1.5mol/l nacl、质量分数1％的ctab，余量为水。

15、优选，所述的裂解液组成如下：200mmol/l c2h6n4s、200mmol/l na2hpo4、100μg/ml蛋白酶k，余量为水。

16、优选，其特征在于，所述的沉淀液组成如下：400mmol/l ch3co2nh4、200mmol/lcacl2、100mmol/l alnh4(so4)2，余量为水。

17、优选，所述的洗脱液为ph＝8.0的100mmol/l tris-hcl。

18、优选，所述的漂洗液为体积分数70％的乙醇水溶液。

19、本发明的有益效果：

20、1.本发明无需使用无需裂解介质玻璃珠、纯锆珠等进行研磨，直接使用旋转振荡器释放、裂解沙滩环境dna，降低提取成本。

21、2.本发明首次使用大容量5ml离心管提取沙滩dna，提高了提取产量。目前的技术大多是使用10ml或者50ml管采集冰冻后再提取样品，步骤更为繁琐。

22、3.本发明提取的dna具有高完整度和多样性，适合edna宏条形码技术进行物种多样性分析。

23、4.本发明通过改进裂解、提取步骤，提高了dna提取的效率和质量；目前市场上常见土壤提取试剂盒中有研磨珠子，而本发明的方法表明不用研磨珠子也可行。

技术特征：

1.一种针对沙滩样本的总dna提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提缓冲溶液组成如下：100mmol/lph8.0的tris-hcl、100mmol/l ph8.0的edta-na2、100mmol/l磷酸钠缓冲液、1.5mol/lnacl、质量分数1％的ctab，余量为水。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的裂解液组成如下：200mmol/lc2h6n4s、200mmol/l na2hpo4、100μg/ml蛋白酶k，余量为水。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的沉淀液组成如下：400mmol/lch3co2nh4、200mmol/l cacl2、100mmol/l alnh4(so4)2，余量为水。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的洗脱液为ph8.0的100mmol/l tris-hcl。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的漂洗液为体积分数70％的乙醇水溶液。

技术总结本发明公开了一种针对沙滩样本的总DNA提取方法，通过野外采集沙滩样本，无需玻璃珠等裂解介质，利用沙子特性释放沉积物中的DNA；该方法特别适用于沙滩环境生物检测、基因组测序以及宏条形码技术；能够有效去除混合液中的杂质，获得很好的DNA产量和质量，提高了提取效率，降低了提取成本。技术研发人员：付夏楠,魏世超,周文良受保护的技术使用者：南方海洋科学与工程广东省实验室（广州）技术研发日：技术公布日：2024/12/2