一种编辑重组细胞端粒的sgRNA序列及其靶向抗肿瘤的应用

本发明涉及生物，特别是涉及一种编辑重组细胞端粒的sgrna序列及其靶向抗肿瘤的应用。

背景技术：

1、端粒是位于真核细胞线状染色体末端的一小段dna-蛋白质复合体，具有维持染色体末端稳定、控制细胞分裂次数和细胞衰老的重要作用。端粒的长度随着细胞分裂逐渐缩短，最终会达到一个临界值，当这个值被消耗殆尽时，细胞将无法继续分裂，从而进入衰老状态或死亡。因此，端粒在调控细胞生命周期中起着至关重要的作用。端粒长度的变化与肿瘤发生发展密切相关，肿瘤细胞的端粒延长机制赋予了肿瘤细胞无限增殖的能力。肿瘤细胞端粒延长机制主要涉及两种途径：端粒酶依赖的途径和端粒延长替代机制(alt)。端粒酶是一种rna依赖的dna多聚酶，能够在染色体末端合成端粒重复序列(ttaggg)，从而维持端粒长度，使细胞保持旺盛的分裂增殖能力。大约85％～90％的肿瘤细胞通过激活端粒酶来维持端粒长度。然而，在端粒酶失活或不足的情况下，一些肿瘤细胞能够通过其他机制维持端粒长度，这些机制统称为端粒延长替代机制。

2、tert基因编码端粒酶逆转录酶，这是一种在大多数癌细胞中高度活化的酶。端粒酶逆转录酶能够延长端粒，从而使癌细胞逃避正常的细胞衰老和死亡过程。tert启动子是调控tert基因表达的重要区域。在许多癌症类型中，tert启动子突变导致tert基因的异常激活，从而促进肿瘤细胞的无限增殖。利用tert启动子调控的基因疗法或溶瘤病毒可以特异性地靶向癌细胞。例如，通过构建tert启动子驱动的基因表达载体，能够在癌细胞中高效表达毒性基因或促凋亡基因，从而杀伤肿瘤细胞。afp基因编码甲胎蛋白，通常在胎儿时期高表达，成年后在正常组织中表达极低。然而，在某些肝细胞癌和胚胎性肿瘤中，afp基因再次异常高表达。afp启动子是调控afp基因表达的重要区域，在肝细胞癌中常被激活。afp的血清水平升高是肝细胞癌的重要诊断标志物。检测血清中afp水平有助于肝癌的早期发现和监测。通过利用afp启动子驱动特定的治疗基因，可以在高afp表达的肿瘤细胞中实现靶向基因治疗。例如，构建afp启动子驱动的溶瘤病毒或毒性基因表达载体，可以特异性地在肝细胞癌中高效表达，从而杀伤肿瘤细胞，减少对正常组织的副作用。有研究表明，肿瘤细胞端粒的轻微氧化损伤即可诱导肿瘤细胞死亡，这提示肿瘤细胞的端粒是肿瘤潜在治疗靶点之一。tert和afp启动子在肿瘤细胞中的异常活化为靶向癌症诊断和治疗提供了独特的机会。通过研究和应用这些启动子的特异性调控机制，能够开发出更精准和高效的癌症治疗方法。

3、crispr/cas9技术是当前一种极为常用的基因编辑工具，根据应用的不同，至今已经开发出多种类型的cas核酸酶，比如常用的spcas9以及sacas9。虽然在癌症研究中，crispr/cas9可以用于敲除或修复肿瘤特异性基因，以期达到抑制肿瘤生长的目的，但针对不同类型的cas核酸酶，需要搭配不同的sgrna，sgrna是决定治疗方案精度和效率的关键因素。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种编辑重组细胞端粒的sgrna序列及其靶向抗肿瘤的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该sgrna能够特异性识别端粒dna重复序列，结合tert或afp肿瘤特异性启动子，利用spcas9核酸酶对其进行持续切割，从而缩短肿瘤细胞端粒长度，最终杀伤肿瘤细胞。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种编辑重组细胞端粒的sgrna，所述sgrna的核苷酸序列如seq idno.1或seq id no.2所示。

4、本发明还提供转录所述的sgrna的dna分子。

5、本发明还提供含有所述的sgrna或所述的dna分子的表达盒。

6、本发明还提供含有所述的表达盒的重组载体。

7、本发明还提供含有所述的重组载体的重组菌。

8、本发明还提供一种所述的sgrna或所述的dna分子或所述的表达盒或所述的重组载体或所述的重组菌在如下任一项中的应用：

9、(1)在制备缩短肿瘤细胞端粒长度的病毒及药物中的应用；

10、(2)在制备抗肿瘤病毒及药物中的应用。

11、进一步的，所述肿瘤包括胶质瘤、肺癌、肝癌和乳腺癌。

12、进一步的，当重组载体的启动子为cmv或tert时，所述肿瘤包括胶质瘤、肺癌、肝癌和乳腺癌；当重组载体的启动子为afp时，所述肿瘤为肝癌。

13、本发明还提供一种缩短肿瘤细胞端粒长度或者抗肿瘤的药物，包含所述的sgrna。

14、本发明公开了以下技术效果：

15、本发明公开的sgrna能够特异性识别端粒dna重复序列，然后利用tert或afp肿瘤特异性启动子，将spcas9核酸酶引导到肿瘤细胞中所述目的基因片段，并对其进行持续切割，从而缩短肿瘤细胞端粒长度，最终杀伤肿瘤细胞。通过实验证实，端粒切割腺病毒感染肝癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或胶质瘤细胞9天后，细胞数目明显减少、细胞端粒长度明显缩短。说明本发明基于crispr/cas9基因编辑技术，通过设计的sgrna和tert或afp肿瘤特异性启动子，可以实现对肿瘤细胞端粒的靶向基因编辑，可以高效引起肿瘤细胞端粒序列缩短，最终导致肿瘤细胞死亡。

技术特征：

1.一种编辑重组细胞端粒的sgrna，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列如seq idno.1或seq id no.2所示。

2.转录权利要求1所述的sgrna的dna分子。

3.含有权利要求1所述的sgrna或权利要求2所述的dna分子的表达盒。

4.含有权利要求3所述的表达盒的重组载体。

5.含有权利要求4所述的重组载体的重组菌。

6.一种权利要求1所述的sgrna或权利要求2所述的dna分子或权利要求3所述的表达盒或权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组菌在如下任一项中的应用：

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括胶质瘤、肺癌、肝癌和乳腺癌。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，当重组载体的启动子为cmv或tert时，所述肿瘤包括胶质瘤、肺癌、肝癌和乳腺癌；当重组载体的启动子为afp时，所述肿瘤为肝癌。

9.一种缩短肿瘤细胞端粒长度或者抗肿瘤的病毒和药物，其特征在于，包含权利要求1所述的sgrna。

技术总结本发明公开了一种编辑重组细胞端粒的sgRNA序列及其靶向抗肿瘤的应用，属于生物技术领域。所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。通过实验证实，该sgRNA能够特异性识别端粒DNA重复序列，然后利用TERT或AFP等肿瘤特异性启动子制备病毒，将SpCas9核酸酶和sgRNA序列引导到肿瘤细胞中，并对其端粒进行切割重组，实现对肿瘤细胞端粒的靶向基因编辑，可以高效引起肿瘤细胞端粒序列缩短和失去对染色体的保护功能，最终导致肿瘤细胞死亡。技术研发人员：周其冈,尤永平,倪柠杰,范轶鑫,黄翰宇,翟宇翔受保护的技术使用者：南京医科大学技术研发日：技术公布日：2024/12/12