集成芯片及其制作方法与单细胞俘获/培养方法

本发明属于微流控生物芯片，具体涉及一种利用微流控技术在高通量条件下实现单细胞俘获和培养的单细胞俘获/培养集成芯片及其制作方法，以及使用该集成芯片的单细胞俘获和培养的方法。

背景技术：

1、随着微流控和微机械加工技术的不断完善和发展，微全分析系统(micro totalanalysis system，μ-tas)在细胞水平上的生物学研究和临床实验诊断等领域里的优势日趋显著。微流控芯片因功能单元尺寸与细胞大小相当、精度高和检测快速方便等优点，在细胞分析方面表现出了明显的优势。该技术可以将现行所有的细胞分析步骤和过程(如细胞操纵、细胞捕捉/筛选、细胞培养以及在线实时动态监测分析等)整合于一块微芯片上，实现分析操作的一体化，可以减少操作过程中对细胞样本的损伤和污染，非常适合单细胞俘获/培养，此类微芯片叫作微流控生物芯片。本发明高通量单细胞俘获/培养集成芯片也属于此类微流控生物芯片。

2、如何从一定体积的细胞悬浮液中分离单个细胞，是进行单细胞分析的前提。传统实验室获取单细胞的方法主要是有限稀释法和显微操作法，在操纵微米尺度细胞样本方面存在着效率低、精度差以及成本高等缺点。目前主流的微流控技术是一种获取单细胞的有效方法，相较传统手段它具有高精度、小尺寸、高通量、捕获效率高的优点。

3、微流控单细胞捕获芯片种类众多，根据是否需要外力诱导，可分为主动捕获和被动捕获两大类。其中，主动捕获微流控芯片借助外力作用，如磁、电、光等实现捕获；被动捕获利用流体动力效应实现捕获，无需施加任何外力和标记。

4、基于流体动力原理的微流控单细胞捕获芯片的捕获结构主要可分为：

5、(1)微井结构，微井结构利用细胞的自重将单细胞沉降在每个独立的微井中，达到细胞捕获目的，使用这种结构的单细胞捕获芯片具有高通量和操作简便等优点，但完成一次捕获所耗费时间较长，同时可能会出现微井中未捕获单细胞或捕获多个单细胞的现象，另外，在微井中不方便控制溶液的交换，细胞增殖条件受限；

6、(2)微柱结构，基于微柱阵列的单细胞捕获芯片通常在主流体通道上设计单细胞拦截物，通过控制流体流动实现单细胞捕获。这种结构的单细胞捕获芯片制作工艺成熟、操作方便，且能阵列设计实现高通量下的单细胞捕获。此外，微柱结构的设计为单细胞的灌流培养提供了一定的支撑力，可以降低细胞受到的拉伸应力，提高细胞活性。但是，基于微柱阵列的单细胞捕获芯片通常和主流体通道平行，会造成捕获的单细胞分布不均，细胞捕获处的局部流体阻力增大，容易造成通道堵塞及多细胞聚集的现象。

7、(3)旁路通道结构，基于旁路通道的单细胞捕获芯片通过在微流控芯片中设计流阻较大的主通道和流阻较小的侧通道，当细胞在主通道中流动时会被推向流阻较小的侧通道，通过在主通道与侧通道的连接处设计捕获结构，实现单细胞捕获。这一结构可以减少通道堵赛和多细胞聚集的现象，具有高通量的优点，降低了细胞损伤，有利于后续细胞培养。同时它的单细胞捕获效率也极高(90％以上)。

8、随着单细胞分析学的不断发展，对单细胞分析微流控芯片提出了更高的要求，要求在微流体装置能够进行长期的细胞培养，以便研究细胞分化、细胞发育等活动。

9、但是，现有的微流控生物芯片存在以下不足：1、功能相对单一，有的只能实现单细胞俘获的单一功能，有的只能实现单细胞培养的单一功能。2、现有的微流控生物芯片也存在通量不足的问题，使得其一次操作的俘获或培养的单细胞数量不够多，难以满足临床医学与科学研究应用中需要。3、单细胞俘获的有效性、稳定性不够，不能达到每个单细胞俘获单元都能俘获单细胞。

10、本发明在前述三种捕获结构的基础上，针对单细胞捕获后的长期培养需求，设计了一种非平面结构的高通量单细胞捕获、培养集成芯片，解决目前微流控芯片存在的俘获细胞的效率低、通量低、活性差、长期培养困难的问题。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种利用微流控技术在高通量条件下实现单细胞俘获和培养的单细胞俘获/培养集成芯片及其制作方法，以及使用该集成芯片的单细胞俘获和培养的方法。解决现有技术存在的系列问题：1、将单细胞俘获和培养的单细胞俘获/培养功能集成于一体，同时解决单细胞俘获和培养的两个技术问题。2、解决现有的微流控生物芯片也存在的通量不足的问题，使得其一次操作的俘获或培养的单细胞数量足够多，以满足临床医学与科学研究应用中需要。3、解决现有的微流控生物芯片也存在的单细胞俘获的有效性、稳定性不够问题。

2、为了解决上述技术问题，本发明高通量单细胞俘获/培养集成芯片所采用的技术方案为：

3、一种高通量单细胞俘获/培养集成芯片，包括硅基片，与该硅基片上下相贴合的上玻璃基片、下玻璃基片，三者键合成一体；其特征在于，在所述硅基片上表面设有顶层流道，顶层流道两端分别开设不贯穿所述硅基片的顶层流道入口、顶层流道出口，所述上玻璃基片在顶层流道入口、顶层流道出口位置对应处分别开设贯穿上玻璃基片，并分别与顶层流道入口、顶层流道出口相对接的顶层进液口与顶层出液口；所述硅基片下表面设有底层流道，底层流道两端分别开设贯穿硅基片的底层流道入口、底层流道出口，所述上玻璃基片在底层流道入口、底层流道出口位置对应处分别开设贯穿上玻璃基片，并分别与底层流道入口、底层流道出口相对接的底层进液口、底层出液口；所述上玻璃基片下表面与硅基片上表面相键合形成顶层流道腔，下玻璃基片上表面与硅基片下表面相键合形成底层流道腔，顶层流道腔、底层流道腔之间穿通该硅基片厚度开设呈阵列分布的细胞俘获/培养单元，每个细胞俘获/培养单元的位于顶层流道腔的上开口与位于底层流道腔的下开口上下相通，上开口2倍以上地大于待俘获/培养的单细胞直径，下开口小于待俘获/培养的单细胞直径，所述高通量单细胞俘获/培养集成芯片仅通过呈阵列分布的细胞俘获/培养单元将顶层流道腔、底层流道腔相联通，从而形成完整的芯片内部腔体结构。

4、以下为本发明高通量单细胞俘获/培养集成芯片进一步的方案：

5、所述硅基片上表面的顶层流道从顶层进液口至顶层出液口呈经分多级细化分流后又经分多级粗化合流的布置方式，最细一级的各顶层流道呈相互平行布置；所述硅基片下表面的底层流道从底层进液口至底层出液口也呈经分多级细化分流后又经分多级粗化合流的布置方式，最细一级的各底层流道也呈相互平行布置。

6、所述硅基片上表面的顶层流道从顶层流道入口至顶层流道出口先分化为2条较细的顶层流道，该2条顶层流道继续分化成4条再细的顶层流道，该4条顶层流道继续分化成更细的8条顶层流道，8条顶层流道通过顶层流道中间的细胞俘获/培养区域后，8条顶层流道合并为较粗的4条顶层流道，4条顶层流道合并为再粗的2条顶层流道，2条顶层流道合并为更粗的单条顶层流道，分化后的各顶层流道之间设置有隔离，且位于流道中心的最细一级的8条顶层流道相互平行布置；所述硅基片下表面的底层流道从底层流道入口至底层流道出口也先分化为2条较细的底层流道，该2条底层流道继续分化成4条再细的底层流道，该4条底层流道继续分化成更细的8条底层流道，8条底层流道通过底层流道中间的细胞俘获/培养区域后，8条底层流道合并为较粗的4条底层流道，4条底层流道合并为再粗的2条底层流道，2条底层流道合并为更粗的单条底层流道，分化后的各底层流道之间设置有隔离，且位于流道中心的最细一级的8条底层流道也相互平行布置。

7、本发明高通量单细胞俘获/培养集成芯片，所述硅基片为厚度为300μm、表面为[100]晶面、双面抛光的硅基片，所述硅基片上表面的顶层流道深20至30μm，宽度在100至700μm，保证高通量条件下细胞可以顺畅通过；所述硅基片下表面的底层流道深230至240μm，宽度在100至700μm，流道容积保证细胞培养液通过。

8、所述每个细胞俘获/培养单元呈倒金字塔形状，其上开口与下开口呈四边形，上开口是一个边长为60至70μm的正方形，远大于细胞直径10至20μm，比分化后的单流道的宽度略窄，保证细胞可以通过；位于硅基片底层流道上的下开口是一个边长为5至10μm的正方形，小于细胞直径，确保细胞被限制在细胞俘获/培养单元中。

9、所述细胞俘获/培养单元给被俘获后的细胞提供足够的增殖空间，一个细胞俘获/培养单元可容纳20至30个细胞，使用时流动的细胞培养液为细胞营造了良好的生存环境。

10、所述顶层流道与底层流道在硅基片上表面、下表面呈现相互十字交叉布置，提高了硅基片的面积利用，不同层交叉结构的设计有利于上、下层流道流速差的形成。

11、为了解决上述技术问题，本发明高通量单细胞俘获/培养集成芯片的制作方法所采用的技术方案为：

12、一种高通量单细胞俘获/培养集成芯片的制作方法，包括可不分先后各自进行的硅基片的制作和上玻璃基片、下玻璃基片的选用制作，及其三者的键合；其中，硅基片的制作步骤包括：

13、步骤一、采用四英寸、双面抛光、300μm厚度的硅基片作为衬底；

14、步骤二、双面热氧化工艺在硅基片正、反面上均形成1μm厚的氧化硅层；

15、步骤三、硅基片反面旋涂光刻胶，按照设计版图对硅基片反面光刻，显影出底层流道入口、底层流道、底层流道出口图案；

16、步骤四、采用samco rie工艺组合，rie反面刻蚀硅基片氧化硅层1μm，形成底层流道入口、底层流道、底层流道出口的刻蚀窗；

17、步骤五、采用深反应等离子刻蚀，反面刻蚀硅基片240μm，刻蚀形成底层流道，完成底层流道入口、底层流道出口的反面部分刻蚀；

18、步骤六、采用去胶工艺组合，去除前述步骤后硅基片上残留的光刻胶与杂质；

19、步骤七、采用teos lpcvd工艺,即化学气相沉积氧化硅工艺，在硅基片上化学气相沉积氧化硅，形成厚度为0.4μm的氧化硅层；

20、步骤八、在硅基片正面旋涂光刻胶，按照设计版图在硅基片正面光刻显影出底层流道入口、顶层流道、顶层流道入口、顶层流道出口、底层流道出口图案，其中顶层流道、顶层流道入口、顶层流道出口三者的图案同时形成，且后续制作工艺相同；

21、步骤九、采用samco rie工艺组合，rie正面刻蚀硅基片氧化硅1.4μm，形成底层流道入口、顶层流道、顶层流道入口、顶层流道出口、底层流道出口的刻蚀窗；

22、步骤十、采用去胶工艺组合，去除前述步骤后硅基片上残留的光刻胶与杂质；

23、步骤十一、采用深反应等离子刻蚀，正面刻蚀硅基片20μm，刻蚀形成顶层流道、顶层流道入口、顶层流道出口，完成底层流道入口、底层流道出口的正面部分刻蚀；

24、步骤十二、采用teos lpcvd(化学气相沉积氧化硅)工艺，在硅基片上化学气相沉积氧化硅0.4μm；

25、步骤十三、在硅基片正面旋涂光刻胶，按照设计版图在硅基正面继续光刻显影出底层流道入口、底层流道出口图案，同时光刻显影出细胞俘获/培养单元图案；

26、步骤十四、采用samco rie工艺组合，rie正面刻蚀硅基片氧化硅0.4μm，形成底层流道入口、细胞俘获/培养单元、底层流道出口刻蚀窗；

27、步骤十五、采用去胶工艺组合，去除前述步骤后硅基片上残留的光刻胶与杂质；

28、步骤十六、采用各向异性湿法腐蚀工艺，各向异性腐蚀液腐蚀硅基片约40μm，形成细胞俘获/培养单元，完成底层流道入口、底层流道出口的刻蚀；

29、步骤十七、采用sio2(金属后)腐蚀工艺组合boe工艺，去除硅基片上的残余氧化硅掩膜，释放并形成底层流道入口、底层流道出口；

30、步骤十八、选用两片4英寸玻璃基片，一片不做处理作为下玻璃基片，另外一片使用激光打孔工艺按照设计好的版图在玻璃基片上打孔，制成上玻璃基片。

31、步骤十九、将制备完成的硅基片和上玻璃基片、下玻璃基片对准键合，完成至少1个高通量单细胞俘获/培养集成芯片的制作。

32、本发明高通量单细胞俘获/培养集成芯片的制作方法进一步的方案：

33、作为所述硅基片的制作材料，采用硅基片板状集合体，作为所述上玻璃基片的制作材料，采用上玻璃基片板状集合体，作为下玻璃基片的制作材料，采用下玻璃基片板状集合体，所述步骤十九采用将制备完成的硅基片板状集合体和上玻璃基片板状集合体、下玻璃基片板状集合体对准键合，采用硅-玻璃阳极键合方式形成集成芯片板状集合体；再采用硅芯片切割机，沿着设计好的切割线，切割出单个集成芯片，成批量地完成高通量单细胞俘获/培养集成芯片的制作。

34、为了解决上述技术问题，本发明单细胞俘获/培养方法所采用的技术方案为：

35、一种单细胞俘获/培养方法，其特征在于，使用以上所述的高通量单细胞俘获/培养集成芯片，首先，通过所述顶层进液口、底层进液口向集成芯片顶层流道与底层流道中同时输入相同的不含细胞的细胞培养溶液，将芯片内部腔体充满后，暂停溶液的输入，并保持设定时间，完成对芯片的预处理；然后，通过所述顶层进液口往芯片顶层流道持续通入含有细胞的细胞培养溶液，其流速为流速a，于此同时，通过所述底层进液口向芯片底层流道持续通入不含细胞的细胞培养溶液，其流速为流速b，适当调整流速，使得顶层、底层流道中液体的流速满足：流速a小于流速b；在此条件下，顶层流道中位于细胞俘获/培养单元上的细胞在流速差的影响下会自发地向细胞俘获/培养单元的下方开口处移动，最终细胞在流速差的作用下被这个小孔所吸附；在所有细胞俘获/培养单元均有细胞被俘获时，向顶层流道持续通入不含细胞的细胞培养溶液，流速不改变，培养液会将培养单元中多余细胞带出，确保每个细胞俘获/培养单元中含有单个细胞，流动的培养液为细胞提供了营养条件，最终达到单细胞俘获、培养的目的；以上过程中，芯片内部腔体充满后多余的细胞培养溶液从通过顶层出液口、底层出液口溢出。

36、本发明单细胞俘获/培养方法进一步的方案：

37、使用4根大小及长度合适的软管，软管的其中一端分别连接顶层进液口、顶层出液口、底层进液口、底层出液口，连接顶层进液口的软管另一端经微型输送泵连接含有细胞或不含细胞的细胞培养溶液容器，连接底层进液口的软管另一端经微型输送泵连接不含细胞的细胞培养溶液容器，由微型输送泵驱动完成所述细胞培养溶液向芯片内部腔体的输送过程；连接顶层出液口与连接底层出液口的软管另一端通往废液容器；芯片内部腔体充满后多余的细胞培养溶液从通过顶层出液口、底层出液口溢出并经所述软管流至废液容器。

38、本发明高通量单细胞俘获/培养集成芯片，采用上玻璃基片下表面与硅基片上表面相键合形成顶层流道腔，下玻璃基片上表面与硅基片下表面相键合形成底层流道腔，顶层流道腔、底层流道腔之间穿通该硅基片厚度开设呈阵列分布的细胞俘获/培养单元，每个细胞俘获/培养单元的位于顶层流道腔的上开口与位于底层流道腔的下开口上下相通，上开口2倍以上地大于待俘获/培养的单细胞外径，下开口小于待俘获/培养的单细胞外径，芯片仅通过呈阵列分布的细胞俘获/培养单元将顶层流道腔、底层流道腔相联通，从而形成完整的芯片内部腔体结构。使用时，向集成芯片顶层流道与底层流道中通入相同的不含细胞的细胞培养溶液，待溶液将芯片充盈；然后，往芯片顶层流道持续通入含有细胞的培养溶液，于此同时，以更高流速向芯片底层流道持续通入不含细胞的细胞培养液，适当调整流速，使得顶层、底层流道中液体的流速具有足够的流速差，顶层流道中位于细胞俘获/培养单元上的细胞在流速差的影响下向细胞俘获/培养单元的下方开口处运动，最终细胞在流速差的作用下被这个小孔所吸附；在所有单元均有细胞被俘获时，向顶层流道持续通入不含细胞的细胞培养液，流速不改变，培养液会将培养单元中多余细胞带出，可以确保单个单元中含有单个细胞，流动的培养液为细胞提供了营养条件，最终可以达到单细胞俘获、培养的目的。

39、本发明高通量单细胞俘获/培养集成芯片，很好地解决了现有技术存在的系列问题：1、将单细胞俘获和培养的单细胞俘获/培养功能集成于一体，同时解决单细胞俘获和培养的两个技术问题。2、解决了现有的微流控生物芯片也存在的通量不足的问题，使得其一次操作的俘获或培养的单细胞数量足够多，完全以满足现阶段临床医学与科学研究应用中的应用需要。3、解决了现有的微流控生物芯片也存在的单细胞俘获的有效性、稳定性不够问题。一次操作就能达到芯片内的每个单细胞俘获单元都能俘获到一个单细胞。并可以在各细胞俘获/培养单元内培养增殖。

40、本发明高通量单细胞俘获/培养集成芯片具有如下显著优势：

41、(1)与传统微流控细胞俘获芯片相比，本发明在俘获细胞的同时还为细胞提供了相应的增殖条件，在捕获到细胞的同时还可以观察细胞各种活动。

42、(2)芯片采用mems技术，芯片的一致性好，且可以实现大规模批量制备，降低单器件制造成本。

43、(3)与传统平面上制作的微流控芯片相比，本发明创新性设计微流控芯片的结构，应用流体力学实现水平方向下的细胞转移、垂直方向下的细胞俘获。

44、本发明针对单克隆抗体制备技术中高效价杂交瘤细胞高效筛选需求，基于微流控技术、显微图像，在结构上做出创新，研制了一种高通量单细胞俘获、培养集成芯片，解决传统技术手段下俘获细胞的效率低、活性差的问题，为杂交瘤细胞的高通量俘获和培养提供技术方案，对于提高杂交瘤细胞的俘获效率，缩短单克隆抗体制备时间。本发明高通量单细胞俘获/培养集成芯片，具有单细胞俘获/培养稳定可靠等特点，并且可批量化制造，成本低，具有重要的实际应用价值。