一种L-天冬氨酸在制备山羊卵母细胞体外成熟培养液中的应用

本发明属于卵母细胞培养领域，具体地，涉及一种l-天冬氨酸在制备山羊卵母细胞体外成熟培养液中的应用。

背景技术：

1、l-天冬氨酸(l-asp)是一种有机化合物，化学式为c4h7no4。白色结晶或结晶性粉末，味微酸。氨基酸是用于体外培养人类受精卵至囊胚阶段的培养液的必需成分。使用此类培养液可显著提高移植到子宫后植入的胚胎比例，并减少需要移植才能怀孕的胚胎数量。

2、研究发现，特定氨基酸在猪[1]、鼠[2]、山羊[3]和牛[4]的卵母细胞成熟过程中发挥着作用。例如，卵泡天冬氨酸浓度已被证明与人类卵母细胞形态的改善、中期ii(mii)卵母细胞的增加和受精率直接相关[5]。bahrami等人报道称，含有谷氨酰胺、脯氨酸和异亮氨酸的特定培养液可用于牛卵母细胞成熟和成功受精[6]。半胱氨酸单独或与谷氨酸和甘氨酸结合使用，可提高卵母细胞和卵丘细胞中的谷胱甘肽水平，从而促进发育谷氨酰胺已被证明能促进卵母细胞核成熟，并在葡萄糖或乳酸存在的情况下诱导卵丘扩张[7]。卵母细胞和胚胎的质量与氨基酸代谢有关[8]。研究表明，发育不良的卵母细胞表现出更高的谷氨酰胺消耗水平、更高的丙氨酸合成水平和更低的总氨基酸消耗水平[9]。以上研究表明氨基酸在提高母畜繁殖性能发挥重要作用，但l-asp在对促进山羊卵母细胞成熟方面的研究未见系统报道。

3、本发明研究结果表明，l-asp能降低山羊卵母细胞ros水平，增加线粒体活性，提高卵母细胞成熟率。因此，本发明提供了一种由l-asp与山羊卵母细胞培养液组成的新培养液，用于提高山羊卵母细胞成熟率。为了深入、系统研究l-asp对山羊卵母细胞成熟的影响机制，本发明团队拟在现有工作基础上，综合利用细胞生物学、分子生物学、蛋白质组学和生物信息学的方法，开展l-asp对提高山羊卵母细胞成熟率的分子机制进行研究，以期为提高山羊卵母细胞成熟率培养液的开发提供理论依据。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种l-天冬氨酸在制备山羊卵母细胞体外成熟培养液中的应用。制备的山羊卵母细胞体外成熟培养液可以提高山羊卵母细胞体外成熟率，即l-天冬氨酸在促进山羊卵母细胞体外成熟的应用，从而实现改善山羊卵母细胞质量。

2、为了实现上述发明目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

3、本发明所述的一种l-天冬氨酸在制备山羊卵母细胞体外成熟培养液中的应用，所述山羊卵母细胞体外成熟培养液由l-天冬氨酸溶液和基础培养液组成。

4、进一步地，所述l-天冬氨酸溶液是将l-天冬酸粉末用山羊胚胎水(sigma，w1503)加热至55℃充分溶解而得。

5、进一步地，所述基础培养液是由20％发情山羊血清，0.5iu/ml fsh，0.5iu/ml lh，1μg/ml雌二醇，1mm丙酮酸钠，0.05mm l-半胱氨酸，1％ its，20ng/ml egf和25μg/ml庆大霉素的tcm-199制备而成。

6、进一步地，所述山羊卵母细胞体外成熟培养液的l-天冬氨酸溶液的终浓度为0.5-2.5mm。

7、更进一步地，所述山羊卵母细胞体外成熟培养液的l-天冬氨酸溶液的终浓度为2.0mm。

8、本发明所述的一种l-天冬氨酸在制备山羊卵母细胞体外成熟培养液中的应用，经过如下步骤：

9、s1，将l-天冬氨酸粉末，用胚胎水加热55℃进行充分溶解，得l-天冬氨酸溶液，备用；

10、s2，取上述步骤所得l-天冬氨酸溶液，加入到基础培养液中摇匀，使形成l-asp终浓度为2.0mm的山羊卵母细胞体外成熟培养液；

11、s3，将上述步骤s2所得的山羊卵母细胞体外成熟培养液，用移液器加入到四孔板中并覆盖石蜡油放在38.5℃、5％co2、100％湿度培养箱预热一定时间后将完整且致密的卵丘团的卵母细胞放在提前预热好的添加山羊卵母细胞体外成熟培养液的四孔板中并置于38.5℃、5％co2、100％湿度培养箱进行体外成熟培养；

12、s4，用移液器将培养22h后的卵母细胞吸出放入3.5cm培养皿中并加入1ml1％的透明质酸酶反复吹打多次，除去卵母细胞周围的颗粒细胞，在体视显微镜下挑出排出第一极体的成熟卵母细胞(第一极体位于透明带和卵母细胞膜之间)，将成熟的卵母细胞放回成熟液中，并统计卵母细胞成熟情况。

13、本发明所述的l-天冬氨酸在制备促进山羊卵母细胞体外成熟药物制剂中的应用。

14、进步一地，所述药物制剂包含2.0mm的l-天冬氨酸。

15、进步一地，所述药物制剂包含但不限于：注射剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂。

16、本发明的有益效果：

17、本发明添加2.0mm的l-天冬氨酸的山羊卵母细胞体外成熟培养液，山羊卵母细胞体外成熟率为76.66％±4.07％，较空白对照组(59.57％±4.16％)，成熟率上升了17.09％。降低了山羊卵母细胞ros水平，增加了线粒体活性，显著提升了山羊卵母细胞体外成熟卵子率。且大部分的卵丘细胞扩张也显著变好。

技术特征：

1.一种l-天冬氨酸在制备山羊卵母细胞体外成熟培养液中的应用。

2.如权利要求1所述l-天冬氨酸在制备山羊卵母细胞体外成熟培养液中的应用，其特征在于，所述山羊卵母细胞体外成熟培养液由l-天冬氨酸溶液和基础培养液组成。

3.如权利要求2所述l-天冬氨酸在制备山羊卵母细胞体外成熟培养液中的应用，其特征在于，所述l-天冬氨酸溶液是将l-天冬酸粉末用胚胎水加热至55℃充分溶解而得。

4.如权利要求2所述l-天冬氨酸在制备山羊卵母细胞体外成熟培养液中的应用，其特征在于，所述基础培养液是由20％发情山羊血清，0.5iu/ml fsh，0.5iu/ml lh，1μg/ml雌二醇，1mm丙酮酸钠，0.05mm l-半胱氨酸，1％its，20ng/ml egf和25μg/ml庆大霉素的tcm-199制备而成。

5.如权利要求2所述l-天冬氨酸在制备山羊卵母细胞体外成熟培养液中的应用，其特征在于，所述山羊卵母细胞体外成熟培养液的l-天冬氨酸溶液的终浓度为0.5-2.5mm。

6.如权利要求5所述l-天冬氨酸在制备山羊卵母细胞体外成熟培养液中的应用，其特征在于，所述山羊卵母细胞体外成熟培养液的l-天冬氨酸溶液的终浓度为2.0mm。

7.如权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，经过如下步骤：

8.一种如权利要求1所述的l-天冬氨酸在制备促进山羊卵母细胞体外成熟药物制剂中的应用。

9.如权利要求8所述的l-天冬氨酸在制备促进山羊卵母细胞体外成熟药物制剂中的应用，其特征在于，所述药物制剂包含2.0mm的l-天冬氨酸。

10.如权利要求8或9任一项所述的l-天冬氨酸在制备促进山羊卵母细胞体外成熟药物制剂中的应用，其特征在于，所述药物制剂包含但不限于：注射剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂。

技术总结本发明公开了一种L‑天冬氨酸在制备山羊卵母细胞体外成熟培养液中的应用。本发明所述山羊卵母细胞体外成熟培养液由一定量的L‑天冬氨酸和基础培养液组成。经验证在添加了L‑Asp的山羊卵母细胞培养液L‑Asp能降低山羊卵母细胞ROS水平，增加线粒体膜电位活性，显著提高了卵母细胞成熟率。本发明所述的L‑Asp还可用于在制备成促进山羊卵母细胞体外成熟药物制剂。本发明公开的含L‑Asp的山羊卵母细胞体外培养液及其应用对提高山羊体外胚胎的生长发育具有重要意义。技术研发人员：陈祥,王清未,曹茂盛,汪艳妃,李鹏程,季全受保护的技术使用者：贵州大学技术研发日：技术公布日：2024/12/23