一种提高种子外源蛋白表达量的方法

(一)本发明属于生物，特别涉及一种提高种子外源蛋白表达量的方法。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、在植物细胞中生产具有重要价值重组蛋白具有生产成本低、周期短、容易规模化、产能弹性大等优点，植物生物反应器的研究和应用一直是生物产业的热点。种子胚乳组织成分简单、没有复杂的次生代谢产物、容易贮藏等特点，水稻、玉米和大豆等多种植物种子已被成功用于生产多种重组医用、药用或工业用蛋白。虽然前期生产成本低，但是植物源重组蛋白提取和纯化的成本难以压缩，如果表达量不够高就不具备提取纯化价值。外源蛋白表达量决定了植物生物反应器是否具有产业应用价值，当前已经有多种重组蛋白成功在种子中表达，如纤维素酶、漆酶、胰蛋白酶、乳铁蛋白、溶解酶、植酸酶、抗菌肽、血清白蛋白等众多蛋白成功在种子中表达，但仅有部分高表达的蛋白满足产业应用的要求，进入到产业开发阶段。提高重组蛋白的表达量是植物生物反应器应用迫切需要解决的关键问题。

2、植物种子被广泛应用于生产重组蛋白，重组蛋白在种子中积累后，在干燥状态下收获和存储有助于维持蛋白质的稳定性，这些特性使得种子是重组蛋白生产、保存的理想平台，方便后续的加工和应用。提高植物种子中外源蛋白表达量是降低重组蛋白生产成本最为直接的办法。目前已经有多种提高外源蛋白表达量的方法和策略应用于植物生物反应器中，比如筛选适宜的启动子、终止子或增强表达的调控元件，优化密码子，优化蛋白转运和存储等策略(蒋铭轩等，生物技术通报，2023,39(11)：110-122)。通过抑制植物中蛋白酶表达，减少外源蛋白降解是有效提高外源蛋白表达量和产量的方法(邹奇，中国生物工程杂志，2023,43(1)：71-86)。种子中总蛋白含量相对稳定，外源蛋白表达量提高空间相对有限。比如玉米种子中一般总蛋白含量在10％左右，其中醇溶蛋白含量大于60％，现有的研究显示，抑制醇溶蛋白的表达并不会导致玉米籽粒蛋白总量大幅度降低，而是通过蛋白质再平衡导致其它部分蛋白含量提高。因为动物对醇溶蛋白的消耗和吸收效果不好，该策略一般用于改良玉米蛋白品质，但是并不是种子中其他蛋白表达量都能够得到提高(wu，frontplant sci,2014,30(5)240,pmid:24910639)。因为玉米醇溶蛋白具有表达量高、稳定性好等特点，也有研究通过将醇溶蛋白和外源蛋白融合来提高外源蛋白的表达量和稳定性，但是尚未见到通过抑制玉米醇溶蛋白表达来提高重组蛋白表达的报道。

技术实现思路

0、(三)技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种提高种子外源蛋白表达量的方法，所述方法通过抑制醇溶蛋白表达减少内源蛋白合成，实现在种子中外源重组蛋白高表达，降低重组蛋白生产成本。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种提高种子外源蛋白表达量的方法，所述方法包括抑制植物种子中醇溶蛋白的表达，同时特异性表达外源蛋白，实现外源蛋白的高表达和积累。

4、进一步，所述醇溶蛋白包括19kda和22kda的玉米醇溶蛋白。

5、进一步，本发明提供的抑制方法包含但不限于rna干扰、基因编辑技术。优选根据玉米醇溶蛋白基因家族中高度同源序列设计rna干扰序列，优选seq id no：2中912-1718bp所示。

6、进一步，用于抑制玉米醇溶蛋白表达的表达框包括启动子，rna干扰序列和终止子。所述启动子包括但不限于种子特异启动子，优选水稻谷蛋白启动子，如seq id no：2中1-911bp所示；所述rna干扰序列优选seq id no：2中912-1718bp所示；所述终止子可以是常用基因表达框的一般终止子，优选seq id no：2中1719-1796bp所示。

7、进一步，优选用于抑制玉米醇溶蛋白表达的表达框核苷酸序列如seq id no：2所示。

8、进一步，用于特异性表达外源蛋白的表达框包括特异性启动子、外源蛋白编码基因、终止子；所述特异性启动子为水稻谷蛋白启动子、玉米醇溶蛋白启动子等能够在种子中特异性表达外源蛋白的启动子，优选水稻谷蛋白启动子，核苷酸序列如seq no.3中1-983bp所示。所述外源蛋白包括但不限于需要规模生产的工业、医用或饲用蛋白，本发明选择重组脂肪酶，核苷酸序列如seq no.3中984-1935bp所示。所述终止子为可以是常用基因表达框的一般终止子，优选seq id no：3中1936-2424bp所示。

9、进一步，用于特异性表达外源蛋白的表达框核苷酸序列如seq id no：3所示。

10、进一步，所述方法包括构建筛选标记基因表达框，所述筛选标记基因可以是耐草甘膦、耐草铵膦或耐潮霉素等能够将转基因细胞筛选出来的标记基因，优选耐草甘膦表达框，核苷酸序列如seq id no：1所示。

11、进一步，所述方法包括如下步骤：(1)构建含用于抑制玉米醇溶蛋白表达的表达框和筛选标记基因表达框的植物转化载体，将植物转化载体转入植物基因组中，筛选获得玉米醇溶蛋白低表达的转基因植物；(2)构建含用于特异性表达外源蛋白的表达框和筛选标记基因表达框的植物转化载体，将植物转化载体转入植物基因组中，筛选获得外源蛋白高表达的转基因植物；(3)将步骤(1)和步骤(2)筛选的转基因植物杂交，筛选得到醇溶蛋白低表达且外源蛋白高表达的转基因植物。

12、进一步，步骤(1)和(2)中用于构建植物转化载体的基础载体为是将基础载体pcambia1300(ncbi序列编号af234296)，hindiii/xhoi双酶切去除pcambia1300载体中潮霉素基因后的双元载体。植物转化载体转入植物基因组的方法包括农杆菌介导法。

13、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种通过抑制醇溶蛋白表达且特异性表达外源蛋白的方法，能够大幅度提高外源重组蛋白在植物种子中表达量，解决了现有方法利用植物种子生产重组蛋白产量低的问题，提高植物生物反应器的应用价值和经济价值，为在种子中规模化低成本生产重组蛋白提供了新的选择。

技术特征：

1.一种提高种子外源蛋白表达量的方法，其特征在于，所述方法包括抑制植物种子中醇溶蛋白的表达，同时特异性表达外源蛋白，实现外源蛋白的高表达和积累。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇溶蛋白包括19kda和22kda的玉米醇溶蛋白。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制的方法包含rna干扰、基因编辑技术。

4.如权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，抑制植物种子中醇溶蛋白表达的rna干扰序列如seq id no：2中912-1718bp所示。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，用于抑制醇溶蛋白表达的表达框包括启动子，rna干扰序列和终止子，表达框核苷酸序列如seq id no：2所示。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)构建含用于抑制玉米醇溶蛋白表达的表达框和筛选标记基因表达框的植物转化载体，将植物转化载体转入植物基因组中，筛选获得玉米醇溶蛋白低表达的转基因植物；(2)构建含用于特异性表达外源蛋白的表达框和筛选标记基因表达框的植物转化载体，将植物转化载体转入植物基因组中，筛选获得外源蛋白高表达的转基因植物；(3)将步骤(1)和步骤(2)筛选的转基因植物杂交，筛选得到醇溶蛋白低表达且外源蛋白高表达的转基因植物。

技术总结本发明公开了一种提高种子外源蛋白表达量的方法，所述方法包括抑制植物种子中醇溶蛋白的表达，同时特异性表达外源蛋白，实现外源蛋白的高表达和积累。本发明方法能够大幅度提高外源重组蛋白在植物种子中表达量，解决了现有方法利用植物种子生产重组蛋白产量低的问题，提高植物生物反应器的应用价值和经济价值，为在种子中规模化低成本生产重组蛋白提供了新的选择。技术研发人员：林朝阳,佘明君,何逸洋,赵宇受保护的技术使用者：浙江大学技术研发日：技术公布日：2024/12/23