一种莱茵衣藻NPHP4蛋白的兔多克隆抗体及其制备方法和应用

本发明属于生物，具体涉及一种莱茵衣藻nphp4蛋白的兔多克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)是实验室研究中最常用的模式生物。这种单细胞真核绿藻，因其培养条件简单、生长周期短、生长速度快、光合效率高而被称为“光合酵母”。迄今为止，已经实现了对莱茵衣藻核基因组、叶绿体基因组和线粒体基因组的遗传转化。

2、纤毛是高度保守的细胞器，在细胞生物学中具有多种功能。纤毛复杂的超微结构与其多种作用一起进化，包括运动和传感功能。尽管功能多样，但仍存在一个普遍保留的结构核心，包括基于微管的轴丝，具有九轴对称性。轴丝的结构和对称性由其发出的母中心粒或基体决定。在基体正确锚定到质膜后，发育中的纤毛必须建立选择性屏障来隔离对其构造至关重要的分子，因为它缺乏自主的翻译机制。这个区域连接了基体和新生纤毛，被称为过渡区(transition zone，tz)。自20世纪50年代首次通过电子显微镜(em)观察到tz以来，人们已经积累了大量知识来阐明这一关键纤毛区的结构和组成。值得注意的是，由于tz蛋白质突变导致的纤毛相关疾病(纤毛病)数量不断增加，tz在科学研究中的重要性日益凸显。莱茵衣藻是研究真核生物纤毛结构、功能与潜在分子机制的主要模式生物之一，被广泛应用于细胞与分子生物学领域，并且作为纤毛疾病的研究模型。

3、nphp4基因编码肾囊蛋白-4(nphp4)，定位于纤毛过渡区(tz)。nphp4是选择性门控结构的重要组成部分，该门控结构在过渡区发挥作用，控制可溶性和膜相关蛋白在纤毛和细胞质区室之间的移动。人类和其他生物体中nphp4突变的各种表型后果很可能都是由于过渡区缺陷导致蛋白质错误定位所致。为解决研究nphp4纤毛重要功能这一科学问题，寻求一种能特异性识别莱茵衣藻nphp4蛋白的抗体及制备方法显得尤为重要。

技术实现思路

1、本发明提供了一种莱茵衣藻nphp4蛋白的兔多克隆抗体及其制备方法和应用，该多克隆抗体能特异性识别莱茵衣藻nphp4蛋白，可以用于研究纤毛过渡区定位标记；在生物研究领域的应用中可以通过免疫印迹wb法对莱茵衣藻细胞内nphp4蛋白进行定性与定量分析，还可以通过免疫荧光if法标记nphp4蛋白，以探究过渡区中各个蛋白的定位与相互关系，从而为莱茵衣藻为模式生物的纤毛表型变化以及纤毛门控运输等相关调控机制的研究奠定应用基础。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种莱茵衣藻nphp4蛋白的兔多克隆抗体，所述多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻纤毛过渡区的nphp4蛋白；所述nphp4蛋白的氨基酸序列如序列表seq id no.1所示。

3、本发明还提供了一种上述的莱茵衣藻nphp4蛋白的兔多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)利用生物信息学分析获得nphp4蛋白中适合作为抗原片段的氨基酸序列，选定nphp4位于859-1058aa的cdna片段作为免疫抗原多肽，按照大肠杆菌的密码子偏好性，进行全基因合成；所述nphp4位于859-1058aa的cdna片段如序列表seq id no.2所示，对应的氨基酸序列如序列表seq id no.3所示；

5、(2)利用步骤(1)合成的nphp4抗原cdna片段和原核细胞重组表达载体psumo，构建nphp4原核表达载体；

6、(3)将步骤(2)中构建好的nphp4原核表达载体转化至bl21(de3)感受态细胞中，获得重组表达菌株；

7、(4)以一定的条件诱导步骤(3)得到的重组表达菌株蛋白的表达，得到重组表达标签nphp4抗原多肽；

8、(5)将步骤(4)诱导表达的nphp4抗原多肽作为抗原进行兔免疫处理，通过采血获得nphp4蛋白兔多克隆抗血清，将抗血清亲和纯化，获得nphp4蛋白的兔多克隆抗体。

9、进一步的，免疫处理方法为：将nphp4抗原多肽与等体积的完全弗氏佐剂混合，得到第一混合液并注射至免疫兔子体内；28天后，将nphp4抗原多肽与等体积的不完全弗氏佐剂混合，得到第二混合液并注射至所述免疫兔子体内；7天后，将nphp4抗原多肽与等体积的不完全弗氏佐剂混合，得到第三混合液并注射至所述免疫兔子体内；7天后，将nphp4抗原多肽与等体积的不完全弗氏佐剂混合，得到第四混合液并注射至所述免疫兔子体内；7天后，将nphp4抗原多肽与等体积的不完全弗氏佐剂混合，得到第五混合液并注射至所述免疫兔子体内；注射方法为背部多点注射；免疫量为：第一次主注射400μg抗原/只实验兔，第二次到第五次均是注射125μg抗原/只实验兔。

10、本发明还提供了一种上述莱茵衣藻nphp4蛋白的兔多克隆抗体在检测莱茵衣藻nphp4蛋白方面中的应用。

11、进一步的，通过免疫荧光if方法或免疫印迹wb方法来检测莱茵衣藻nphp4蛋白。

12、进一步的，通过免疫荧光if方法检测莱茵衣藻nphp4蛋白的步骤如下：

13、将莱茵衣藻细胞以甲醇穿透法固定后，用pbs buffer清洗3次，每次5min。用封闭液室温封闭1h，用纯化后的nphp4兔多克隆抗体以1:500稀释比于4℃条件下过夜孵育；用含0.5％tween-20的pbs buffer清洗3次，每次5min；用对应波长与种属的荧光标记二抗在37℃孵育1h，再用含0.5％tween-20的pbs buffer清洗3次，每次5min，然后使用不含tween-20的pbs buffer清洗1次，最后使用ddh2o清洗一次，封片后在荧光显微镜下观察nphp4蛋白在纤毛过渡区定位并拍照、作图与分析。

14、进一步的，通过免疫印迹wb方法检测莱茵衣藻nphp4蛋白的步骤如下：

15、将经过-80℃冷冻的衣藻细胞样品用细胞裂解液反复吹打，并加入sds buffer混匀后于95℃金属浴10min；随后进行sds-page电泳，其中浓缩胶电泳时间为20min、电压为80v；分离胶电泳时间为80min、电压为120v；进行转膜，条件为80min、100v；将pvdf膜室温封闭1h后用纯化的nphp4兔多克隆抗体以1:5000稀释比于4℃条件下过夜孵育；回收一抗，用1×tbst洗膜3次，每次10min；使用相对应的二抗室温孵育1h，回收二抗，用1×tbst洗膜3次，随后进行显影，对nphp4蛋白进行定性以及定量分析。

16、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

17、本发明利用莱茵衣藻nphp4表达载体免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，所制备得到的多克隆抗体能特异性识别莱茵衣藻nphp4蛋白，其特点在于效价高和特异性好。生物研究领域的应用中可以通过免疫印迹wb法对莱茵衣藻细胞内nphp4蛋白进行定性与定量分析，还可以通过免疫荧光if法标记nphp4蛋白，以探究过渡区中各个蛋白的定位与相互关系，从而为莱茵衣藻为模式生物的纤毛表型变化、纤毛门控运输以及纤毛疾病病理机制的深入探究，奠定应用基础。