一种肝细胞损伤模型及其构建方法和应用

本发明涉及细胞模型，尤其涉及一种肝细胞损伤模型及其构建方法和应用。

背景技术：

1、肝脏作为体内最大的实质性器官，具有解毒、消化、免疫和代谢等多种功能，功能障碍直接导致多种疾病发生。糖脂代谢紊乱引起的代谢紊乱相关脂肪性肝病日益严重。代谢紊乱相关脂肪性肝病显著增加了2型糖尿病和心血管疾病发生及致死概率，然而至今尚无批准用于其治疗的药物。代谢紊乱相关脂肪性肝病从单纯的肝脂肪变性发展成更具危害的代谢紊乱相关脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化是遗传易感、胰岛素抵抗、氧化应激和肠道菌群紊乱等“多重打击”的结果，其中，脂代谢紊乱引起的肝细胞损伤是病理进程级联反应的关键环节。

2、磷酸乙醇胺磷酸酶etnppl基因又名丙氨酸-乙醛酸转氨酶2类似物1agxt2l1，该基因编码的磷酸乙醇胺磷酸酶能将磷酸乙醇胺petn不可逆地分解为无机磷酸盐、氨和乙醛，并且etnppl对petn的水解具有高度的特异性。petn是cdp-乙醇胺（肯尼迪）途径中磷脂酰乙醇胺合成的前体。此外，petn还被视为线粒体呼吸的潜在抑制剂。乙醛主要在肝脏中进行代谢且具有细胞毒性，可导致肝脂肪变性、炎症、氧化应激和其他损伤。

3、etnppl在大脑和肝脏中大量表达，其异常表达与神经系统和肝脏疾病有关。最近的一项研究表明，etnppl的表达在小鼠大脑早期发育过程中急剧增加，并且etnppl的缺失会改变小鼠大脑的磷脂谱，表明etnppl可以调节脑脂质代谢。在idh1突变的胶质瘤中，etnppl的表达水平与胶质瘤的分级呈负相关，过表达etnppl可以减少胶质瘤干细胞的生长，这表明etnppl可以抑制胶质瘤的发生。etnppl在精神分裂症和躁狂症患者的大脑中显著上调，这可能是神经化学失衡的一种代偿反应。在肝癌组织和细胞中，etnppl的低表达与预后不良有关，而etnppl的过表达可抑制肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，hcc）的迁移和侵袭，这表明etnppl可作为hcc的治疗靶点。etnppl在hcc组织的脂质代谢中发挥重要作用，用sirna沉默etnppl的表达可促进97h和lm3这两种肝癌细胞的脂肪生成。在胰岛素抵抗的hepg2细胞中，etnppl表达上调，沉默etnppl可改善hepg2细胞的胰岛素抵抗。此外，过表达etnppl可诱导hepg2细胞的胰岛素抵抗、活性氧（ros）生成和pi3k/akt通路失活，进而使hepg2细胞发生胰岛素抵抗。另有研究表明，过表达etnppl还能促进精氨酸酶（arg2）的活化，揭示了etnppl可通过调节hepg2细胞中的arg2-ros信号轴进而抑制自噬。

4、目前少有通过基因编辑构建肝细胞损伤的细胞模型的报道，开发肝细胞损伤模型对于肝细胞损伤分子机制解析和靶向治疗措施评价具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明提供一种肝细胞损伤模型及其构建方法和应用。

2、具体地，本发明提供以下技术方案。

3、第一方面，本发明提供一种肝细胞损伤模型的构建方法，所述方法包括：对肝细胞进行基因编辑，以使得所述肝细胞中etnppl蛋白的含量和/或活性提高。

4、虽然目前已知多个信号通路和基因参与肝细胞代谢和功能发挥，但是，目前仍少有通过简单的基因编辑即获得肝细胞损伤模型的研究报道。本发明在研发过程中意外地发现，提高肝细胞中etnppl蛋白的含量和/或活性能够导致肝细胞功能损伤，并同时在还原型谷胱甘肽(gsh)、活性氧(ros)、谷草转氨酶(ast)和谷丙转氨酶(alt)等生理生化指标、线粒体结构和数量、细胞增殖能力、以及肝细胞增殖存活、能量代谢、葡萄糖摄取和胰岛素信号的关键信号通路等方面均表现出异常，特别适用于作为肝细胞损伤模型的构建。与以往的单基因编辑仅会导致个别生理生化指标、细胞结构等异常相比，etnppl单基因编辑即可实现多个关键生理生化指标的改变以及细胞结构和信号通路异常，可实现高效构建肝细胞损伤模型。

5、本发明中，所述etnppl蛋白的含量提高通过以下1）和/或2）实现：

6、1）增加etnppl基因的拷贝数；

7、2）增强etnppl基因的转录和/或翻译调控元件的活性。

8、本发明中，etnppl即磷酸乙醇胺磷酸酶，该蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。etnppl基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

9、在本发明的一些实施方式中，所述etnppl蛋白的含量提高通过增加etnppl基因的拷贝数实现。

10、在本发明的一些具体实施方式中，所述etnppl蛋白的含量提高通过在所述肝细胞的基因组中插入etnppl基因的表达盒实现。

11、优选地，所述etnppl基因的表达盒包含kozak序列和etnppl基因。所述kozak序列为gccacc。

12、优选地，在肝细胞的基因组中插入etnppl基因的表达盒可利用整合型质粒（例如piggybac过表达载体以及4pb辅助载体）实现。

13、本发明中，所述肝细胞为人正常肝细胞。

14、优选地，所述肝细胞为l02肝细胞。

15、l02细胞是一种人类肝细胞，来源于健康人体的肝组织，具有较高的增殖能力，能够在培养基中持续生长和繁殖，保持了肝细胞合成蛋白质、分解有毒物质等多种功能。本发明构建了etnppl基因稳定转染的l02细胞，该细胞中etnppl基因的表达量显著提高；通过实验验证发现，在l02细胞中过表达etnppl基因导致肝细胞代谢功能受损，可用于构建肝细胞损伤模型。

16、第二方面，本发明提供以上所述的方法构建得到的肝细胞损伤模型。

17、优选地，所述肝细胞损伤模型为过表达etnppl基因的l02肝细胞。

18、第三方面，本发明提供以上所述的肝细胞损伤模型在筛选用于预防和/或治疗肝细胞损伤的药物中的应用。

19、第四方面，本发明提供以上所述的肝细胞损伤模型在分析肝细胞损伤分子机制中的应用。

20、第五方面，本发明提供etnppl蛋白或其编码基因在肝细胞损伤模型构建中的应用。

21、第六方面，本发明提供etnppl蛋白或其编码基因或者etnppl蛋白或其编码基因的激活剂在制备用于降低肝细胞抗氧化能力、减少肝细胞线粒体数量、破坏肝细胞线粒体结构和/或抑制肝细胞信号通路pi3k/akt活化的产品中的应用。

22、上述应用中，etnppl蛋白或其编码基因的激活剂为能够提高etnppl蛋白或其编码基因的表达和/或活性的物质，包括但不限于化合物、组合物、蛋白或核酸。

23、本发明的有益效果至少包括：本发明提供一种过表达磷酸乙醇胺磷酸酶基因etnppl损伤肝细胞功能的模型，etnppl在肝细胞中过表达后，还原型谷胱甘肽(gsh)降低，活性氧(ros)、谷草转氨酶(ast)和谷丙转氨酶(alt)升高；线粒体空泡化和结构受损，线粒体数量减少，细胞增殖能力下降；肝细胞增殖存活、能量代谢、葡萄糖摄取和胰岛素信号的关键信号通路pi3k/akt的akt磷酸化位点p-akt-thr308和p-akt-ser473蛋白表达量降低。该过表达etnppl的肝细胞可作为肝细胞代谢功能受损模型，用于肝细胞损伤分子机制解析和作为靶向治疗措施评价的材料。