针对大肠杆菌K88的靶向抗菌肽HI-WK及其制备方法和应用

本发明属于生物，具体涉及一种针对大肠杆菌k88的靶向抗菌肽hi-wk及制备方法和应用。

背景技术：

1、产肠毒素大肠杆菌是人和幼畜腹泻的最常见的病原性大肠杆菌，严重时可致死。其可以通过食物、水源、粪便等多种途径传播，增加了大肠杆菌在幼畜、雏禽、以及人类中爆发的风险，不但对养殖业造成严重的经济损失，更会严重威胁到人类健康。此外，大肠杆菌也是临床上分离出来的最常见耐药菌株之一。

2、以往，畜禽饲料中添加抗生素是防治因大肠杆菌感染导致腹泻等疾病的主要措施。然而，在禁止抗生素滥用的背景下，寻求有效的替代方案以防治畜禽大肠杆菌病，已成为保障养殖业可持续发展的关键环节和当务之急。抗菌肽是一类天然小分子多肽，具有广泛的来源和高安全性，广泛存在于动植物和微生物中，因其独特的细胞膜作用机制而不易产生耐药性。抗菌肽不仅具有抗菌活性，还对病毒、寄生虫和肿瘤等有杀伤作用。因此，抗菌肽已成为生物领域的研究热点，尤其在畜牧兽医领域具有广阔的市场应用前景。

3、然而，现有的大多数抗菌肽仍以广谱抗菌为主，杀灭致病菌的同时也无差别地杀灭其他有益细菌，打破菌群平衡，降低肠道稳态，从而降低畜禽的抵抗力。因此，设计一种能够选择性杀灭畜禽体内大肠杆菌，而对正常细菌无作用或作用较小的靶向肽具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种针对大肠杆菌k88的靶向抗菌肽hi-wk，对大肠杆菌k88具有靶向性。

2、本发明的目的是这样实现的：一种大肠杆菌k88的靶向抗菌肽hi-wk的序列如seqid no.1所示。

3、本发明的另一目的是提供如上所述的一种大肠杆菌k88的靶向抗菌肽hi-wk的制备方法，如下：通过噬菌体展示七肽库(ph.d.tm.-7phage display peptide library)筛选得到的具有大肠杆菌亲和力的短肽hi，其序列如seq id no.2所示，该短肽具有与大肠杆菌结合功能而不具备杀菌活性；在所述的短肽hi的基础上，添加一条活性肽wk，其序列如seqid no.3所示。最后将所述的短肽hi与活性肽wk进行连接，得到多肽hi-wk，其序列如seq idno.1所示；采用固相化学合成法，再经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，完成所述的多肽的制备，再经过抗菌活性的测定、溶血活性的测定和真核细胞毒性的测定，最终命名为抗菌肽hi-wk。

4、本发明的另一目的是提供如上所述的一种针对大肠杆菌k88的靶向抗菌肽hi-wk在制备治疗由大肠杆菌k88感染性疾病的药物中的应用。

5、进一步的，所述的应用为畜牧生产中作为饲料添加剂来治疗大肠杆菌k88感染性疾病药物中的应用。

6、本发明的另一目的是提供如上所述的一种适用于治疗大肠杆菌k88感染的药物，所述药物含有如上所述的抗菌肽hi-wk。

7、本发明的有益效果及优点如下：本发明的方法通过噬菌体展示肽库筛选得到的具有大肠杆菌亲和力的短肽hi，其序列为：himpiqa，该序列具有与大肠杆菌结合功能而不具备杀菌活性；在该亲和序列的基础上，结合构效关系研究在该序列的基础上添加一条活性肽wk，其序列为：wkwpkpkpkpkwkw用以提高对大肠杆菌细胞膜的穿透性。对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现抗菌肽hi-wk与活性肽wk相比，对大肠杆菌k88的抑菌活性提高，而对于其它细菌活性下降。抗菌肽hi-wk对大肠杆菌k88最小抑菌浓度的相比于活性肽wk提高了2倍，而对于其它大肠杆菌的最小抑菌浓度的几何平均数下降了1.78倍。而且靶向肽对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等具有非常弱或无抑菌活性。此外，抗菌肽hi-wk在浓度为128μm时未表现出溶血活性。而且具有较低的溶血活性和真核细胞毒性，该抗菌肽hi-wk在128μm浓度下造成2.3％的红细胞溶血，未能引起10％的红细胞溶血，在128μm浓度下猪小肠上皮细胞ipec-j2的存活率达到了90.28％，综上所述，抗菌肽hi-wk是一种典型的靶向抗菌肽，对大肠杆菌k88具有强烈的靶向性，具有较高的应用价值，其已具备成为饲用抗生素替代物的发展潜力。

技术特征：

1.一种针对大肠杆菌k88的靶向抗菌肽hi-wk，其特征在于，其序列如seq idno.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种针对大肠杆菌k88的靶向抗菌肽hi-wk的制备方法，其特征在于，方法如下：通过噬菌体展示七肽库筛选得到的具有大肠杆菌亲和力的短肽hi，其序列如seq id no.2所示，在所述的短肽hi的c末端连接活性肽wk，所述的活性肽wk序列如seqid no.3所示，得到多肽hi-wk，其序列如seq id no.1所示；采用固相化学合成法，再经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，完成所述的多肽的制备，再经过抗菌活性的测定、溶血活性的测定和真核细胞毒性的测定，最终命名为抗菌肽hi-wk。

3.根据权利要求1所述的一种针对大肠杆菌k88的靶向抗菌肽hi-wk在制备治疗大肠杆菌k88感染性疾病的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的应用为畜牧生产中作为饲料添加剂来治疗大肠杆菌k88感染性疾病药物中的应用。

5.一种适用于治疗大肠杆菌k88感染的药物，所述药物含有如权利要求1所述的抗菌肽hi-wk。

技术总结本发明提供一种靶向大肠杆菌K88的靶向抗菌肽HI‑WK及其制备方法和应用，属于生物技术领域，其序列如SEQ ID No.1所示。通过噬菌体展示七肽文库筛选得到的具有大肠杆菌亲和力的肽段HI，在该亲和序列的基础上，添加一条活性肽WK，其序列如SEQ ID No.3所示，用以提高对大肠杆菌细胞膜的穿透性，得到抗菌肽HI‑WK。进行生物安全性检测发现抗菌肽HI‑WK对大肠杆菌K88最小抑菌浓度的相比于活性肽WK提高了2倍，而对于其它大肠杆菌的最小抑菌浓度的几何平均数下降了1.78倍。此外，抗菌肽HI‑WK在浓度为128μM时未表现出溶血活性，具有较高的应用价值。技术研发人员：董娜,胡明阳,查斯娜,李毓雯,赵璐受保护的技术使用者：东北农业大学技术研发日：技术公布日：2025/1/6