共表达细胞因子IL15和淋巴结归巢信号CCR7的CAR-T细胞的构建方法

本发明涉及car-t免疫细胞，具体涉及共表达细胞因子il15和淋巴结归巢信号ccr7的car-t细胞的构建方法，优化的car-t细胞的提升了增殖、活化、抗凋亡和抗耗竭性，维持低分化表型等优良特性，并在突破免疫屏障抑制、增加肿瘤浸润和改善t细胞活性等方面展现出显著效果的car-t优化策略和应用。

背景技术：

1、car-t疗法具有特异性强，选择性高的特点，已成为时下血液性恶性肿瘤最流行的治疗方法，且展示出显著的应答率和突破性的治疗效果，甚至一部分复发难治性大b细胞淋巴瘤(lbcl)和b细胞急性淋巴性白血病(b-all)患者在cd19 car-t治疗后获得持久的完全缓解。然而，高昂的治疗价格、安全性及治疗后的复发限制了car-t疗法的进一步临床应用。研究表明，car-t细胞耗竭是患者在细胞治疗后疾病复发的主要原因，主要表现为car-t细胞在体内存活、扩增、归巢及肿瘤浸润效果不佳，通常car-t细胞在回输三周后便会消退。因而，延长car-t细胞在体内存活时间，提高car-t细胞体内扩增和归巢能力对于car-t治疗恶性肿瘤的临床应用至关重要。

2、car与免疫调节因子的适当结合可以增强car-t细胞的抗肿瘤能力，同时协同肿瘤反应性受体t细胞的激活及其记忆的形成。细胞因子il15在重塑t细胞记忆样免疫表型，延长存活时间，降低t细胞耗竭标志物表达从而增加抗凋亡特性，及促进干细胞记忆样cd8+t细胞（tscm）表型的保存方面具有显著效果。除了t细胞受损和分化状态影响car-t细胞治疗疗效外，te细胞“归巢缺陷”是导致无效免疫治疗另一主要因素。淋巴结归巢和再循环标记ccr7可促进t细胞淋巴归巢免疫表型，t细胞归巢和外渗可改善car-t细胞在肿瘤微环境中的持久性，t细胞归巢伴随的淋巴细胞再循环，使得体内淋巴细胞在外周免疫器官和组织的分布更趋合理，有望突破免疫屏障的抑制。

3、因此，辅以改善体内car-t细胞扩增/持续性/归巢/趋化等免疫表型的元件，将有望提高car-t细胞疗法在患者恶性肿瘤治疗的应答率和缓解持久性。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供一种共表达细胞因子il15和淋巴结归巢信号ccr7的car-t细胞的构建方法，同时共表达car、细胞因子il15和淋巴结归巢信号ccr7，从而改善car-t细胞的增殖、存活、耗竭等免疫表型，提高car-t细胞在肿瘤治疗中的疗效。

2、共表达细胞因子il15和淋巴结归巢信号ccr7的car-t细胞的构建方法，将il15和ccr7基因替换pcdh-cmv-car-ef1-cogfp-t2a-puro质粒中的cogfp和puro基因得到目的质粒pcdh-cmv-car-ef1-il15-t2a-ccr7，病毒包装后进行转染，il15的核苷酸序列如seq idno.2所示，ccr7的核苷酸序列如seq id no.3所示。

3、进一步的，将15x7-cd19-car-jurkat细胞与数量梯度的靶细胞raji共孵育后，检测car-jurkat细胞中cd69蛋白激活的表达情况；15x7-cd19-car-t细胞与靶细胞raji共孵育后，通过ldh检测靶细胞杀伤效果。

4、进一步的，将cd19-car-t和15x7-cd19-car-t细胞在基础培养基单纯加自体血浆、氨苄/链霉素双抗生素，不添加细胞因子如il2、il15、il7培养的条件下，体外1，2，4，6，10天，细胞计数仪测定car-t细胞的增殖情况；cd19-car-t和15x7-cd19-car-t细胞与靶细胞raji按照不同的效靶比共孵育后，elisa法检测car-t细胞中细胞因子il-2、inf-γ分泌情况。

5、进一步的，基础培养基单纯加自体血浆、氨苄/链霉素双抗生素，不添加细胞因子如il2、il15、il7培养，培养至第6天提取rna，qpcr法检测cd19-car-t和15x7-cd19-car-t细胞表面干细胞样/记忆样标志物il-7r表达和t细胞表面抑制性受体pd-1，tim-3，lag3，ctla4表达情况，评估car-t细胞的免疫表型状态。

6、本发明提供的共表达细胞因子il15和淋巴结归巢信号ccr7的car-t细胞的构建方法，促进t细胞增殖、活化、抗凋亡和耗竭，维持低分化表型等优良特性，并在突破免疫屏障抑制、增加肿瘤浸润和改善t细胞活性等方面展现出显著效果的car-t优化策略和应用。

技术特征：

1.共表达细胞因子il15和淋巴结归巢信号ccr7的car-t细胞的构建方法，其特征在于，将il15和ccr7基因替换pcdh-cmv-car-ef1-cogfp-t2a-puro质粒中的cogfp和puro基因得到目的质粒pcdh-cmv-car-ef1-il15-t2a-ccr7，病毒包装后进行转染，il15的核苷酸序列如seq id no.2所示，ccr7的核苷酸序列如seq id no.3所示。

2.根据权利要求1所述的共表达细胞因子il15和淋巴结归巢信号ccr7的car-t细胞的构建方法，其特征在于，将15x7-cd19-car-jurkat细胞与数量梯度的靶细胞raji共孵育后，检测car-jurkat细胞中cd69蛋白激活的表达情况；15x7-cd19-car-t细胞与靶细胞raji共孵育后，通过ldh检测靶细胞杀伤效果。

3.根据权利要求1所述的共表达细胞因子il15和淋巴结归巢信号ccr7的car-t细胞的构建方法，其特征在于，将cd19-car-t和15x7-cd19-car-t细胞在基础培养基单纯加自体血浆、氨苄/链霉素双抗生素，不添加细胞因子il2、il15、il7培养的条件下，体外1，2，4，6，10天，细胞计数仪测定car-t细胞的增殖情况；cd19-car-t和15x7-cd19-car-t细胞与靶细胞raji按照不同的效靶比共孵育后，elisa法检测car-t细胞中细胞因子il-2、inf-γ分泌情况。

4.根据权利要求1所述的共表达细胞因子il15和淋巴结归巢信号ccr7的car-t细胞的构建方法，其特征在于，基础培养基单纯加自体血浆、氨苄/链霉素双抗生素，不添加细胞因子il2、il15、il7培养，培养至第6天提取rna，qpcr法检测cd19-car-t和15x7-cd19-car-t细胞表面干细胞样/记忆样标志物il-7r表达和t细胞表面抑制性受体pd-1，tim-3，lag3，ctla4表达情况，评估car-t细胞的免疫表型状态。

技术总结本发明涉及一种共表达细胞因子IL15和淋巴结归巢信号CCR7的CAR‑T细胞的构建方法，本方法能够与促进T细胞增殖、活化、抗凋亡和耗竭，维持低分化表型等优良特性，并在突破免疫屏障抑制、增加肿瘤浸润和改善T细胞活性等方面展现出显著效果的CAR‑T优化策略和应用。技术研发人员：李涛,姚宏,黄彩秀,胡小媛受保护的技术使用者：云南省肿瘤医院（昆明医科大学第三附属医院）技术研发日：技术公布日：2025/1/6