高纯度环状RNA的制备方法
- 国知局
- 2025-01-10 13:24:26
本发明属于生物医药,具体涉及高纯度环状rna的制备方法。
背景技术:
1、工程化环状rna(circular rna,circrna)是一类新兴的rna分子,具有不同于线性mrna的分子形式,其首尾通过3’-5’磷酸二酯键相连,形成环状。由于其分子没有自由羟基暴露,所以相较于线性rna分子,环状rna在细胞内具有更强的稳定性。环状rna分子序列中如果包含有内部核糖体进入元件(internal ribosome entry site,ires)和编码区(coding sequence,cds),就可以在哺乳动物体内高效的表达目的蛋白质,因此环状rna被认为是一个新兴的rna药物分子。
2、环状rna的制备具有多种方法,如化学法合成、核酸连接酶合成以及核酶自剪接合成。目前应用最多的是利用i型或者ii型内含子,设计成permuted introns and exons(pie)结构,利用内含子的核酶活性,自剪接获得环状rna。该方法的环状rna制备过程与传统线状mrna相似,首先在t7启动子的下游设计环状rna的模板序列,一般需要包含1组内含子片段,其包含3'剪接位点二核苷酸,内部核糖体进入位点(ires)、5’和3’同源臂、5’和3’端的utr序列和蛋白质编码序列。然后通过体外转录(ivt)过程,获得环状rna的前体,在体系中添加gtp,并将反应温度提升到55℃下进行rna环化,获得环状rna。
3、但是,获得的环状rna是一个混合物,其中包括多种线状rna杂质,如短的dsrna、未环化的前体rna、切割下来的内含子rna、具有缺口的环状rna(nicked cirrna)以及其他切割错误的rna。这些杂质必需通过额外的纯化步骤进行去除,才能得到纯净的环状rna用于生物医药。
4、目前已经有多种方案应用于环状rna的纯化。比如,dsrna的去除可以在ivt步骤直接消除其产生,其方法主要有在ivt体系中添加尿素或离液盐、升高ivt反应温度或者直接利用无dsrna的t7 rna聚合酶。对于其他杂质目前也有多种方法进行去除。
5、利用rnase r降解线状rna是一个常用且简便的方法,但是rnase r降解线状rna的同时,常常也可以将部分环状rna降解掉,因此该方法需要摸索酶与rna的配比以及反应时间;另外,由于设计的工程化环状rna序列中,常常包含有特殊结构,会阻止rnase r对线状rna的降解,因此该方法并不能得到高纯的环状rna。
6、利用分子排阻层析(sec)方法纯化环状rna也是目前大量制备环状rna的常用方法;该方法必需利用孔径很大的层析填料,如赛分科技的srt-sec-1000层析填料已经被广泛利用。该方法的在分离分子量差别较大的杂质时可以有很好的表现,比如内含子的去除;但是在分离分子量差别很小的分子时,表现很差,比如具有缺口的环状rna,该杂质分子与目标环状rna序列相同,分子量相同,其产率非常低。而且该方法的上样量有限,因此该方法很难应用到规模化生产。
7、相对于分子排阻法,利用反相高效液相色谱(rp-hplc)法进行环状rna纯化具有一定的优势,如分辨率有所提高,上样量较大可以进行规模化生产,但是依然不能很好的分离nicked rna、产率较低。而且该方法用到了有毒的有机试剂,其产品很难应用到生物医药方面。
8、因此无法得到高纯度的环状rna严重影响了其产业化应用。
技术实现思路
1、有鉴于此,一些实施例公开了高纯度环状rna的制备方法,包括步骤:
2、s1、构建具有自剪接活性的环化骨架序列;环化骨架序列从5’端至3’端包含以下模块化元件:t7启动子、5’末端同源片段、3’内含子-外显子片段、5’内部同源片段、5’端间隔序列、ires序列、目标片段、3’端间隔序列、3’内部同源片段、外显子片段-5’内含子、3’末端同源片段、xba i内切酶切位点;
3、s2、将环化骨架序列插入puc57载体中,进行质粒扩增;
4、s3、提取质粒,利用xba i内切酶线性化载体,获得体外扩增模版;
5、s4、使用无dsrna的t7rna聚合酶进行体外扩增反应,获取无dsrna的前体rna;
6、s5、前体rna进行环化,得到粗制环状rna原液;粗制环状rna原液中包含有环状rna和线性rna;
7、s6、利用poly(a)或poly(u)聚合酶处理粗制环状rna原液,对其中的线性rna增加poly(a)或poly(u)长尾;
8、s7、利用亲和层析柱对粗制环化rna原液进行纯化,将增加有poly(a)或poly(u)长尾的线性rna与环状rna相分离,得到高纯环状rna;亲和层析柱的亲和层填料的结合基团包括oligo(dt)、oligo(du)、oligo(da)、oligo(dat)、oligo(dct)、oligo(dgt)、oligo(dac)、oligo(dag)、oligo(dau)、oligo(dcu)或oligo(dgu)。
9、本发明实施例公开的高纯度环状rna的制备方法,将杂质线性rna的端部增加了poly(a)或poly(u)长尾,利用亲和层析柱将环状rna与线性rna有效分离,得到了高纯度的环状rna。
技术特征:1.高纯度环状rna的制备方法,其特征在于,包括步骤:
2.根据权利要求1所述的高纯度环状rna的制备方法,其特征在于,步骤s4包括:
3.根据权利要求1所述的高纯度环状rna的制备方法,其特征在于,步骤s5包括:
4.根据权利要求1所述的高纯度环状rna的制备方法,其特征在于,步骤s6包括:
5.根据权利要求1所述的高纯度环状rna的制备方法,其特征在于,步骤s1中,所述环化骨架序列的5’端间隔序列和3’端间隔序列包含有poly(a)、poly(ac)、poly(ag)、poly(u)、poly(ua)、poly(uc)或poly(ug)中一个或多个序列的组合;
6.根据权利要求1所述的高纯度环状rna的制备方法,其特征在于,步骤s1中,所述环化骨架序列的5’端间隔序列和3’端间隔序列不包含有poly(a)、poly(ac)、poly(ag)、poly(u)、poly(ua)、poly(uc)或poly(ug);
7.根据权利要求5或6所述的高纯度环状rna的制备方法,其特征在于,所述结合缓冲液包含有0.5~1.5m的nacl或者0.25~1m的licl。
8.根据权利要求5或6所述的高纯度环状rna的制备方法,其特征在于,所述亲和层析柱的亲和层填料基质为琼脂糖、葡聚糖、sio2或者其他高分子凝胶;结合基团的长度为18~30bp。
9.根据权利要求5所述的高纯度环状rna的制备方法,其特征在于,环化骨架序列中的poly(a)、poly(ac)、poly(ag)、poly(u)、poly(ua)、poly(uc)或poly(ug)序列的长度为10~60bp。
10.根据权利要求9所述的高纯度环状rna的制备方法,其特征在于,线性rna的末端增加的poly(a)或poly(u)长尾的长度,是环化骨架序列中poly(a)、poly(ac)、poly(ag)、poly(u)、poly(ua)、poly(uc)或poly(ug)序列长度的2~10倍。
技术总结本发明公开了高纯度环状RNA的制备方法,包括步骤:构建具有自剪接活性的环化骨架序列;环化骨架序列从5’至3’端包含以下模块化元件:T7启动子、5’末端同源片段、3’内含子‑外显子片段、5’内部同源片段、5’端间隔序列、IRES序列、目标片段、3’端间隔序列、3’内部同源片段、外显子片段‑5’内含子、3’末端同源片段、Xba I内切酶切位点;将环化骨架序列插入pUC57载体中,进行质粒扩增;利用Xba I内切酶线性化载体,获得体外扩增模版;使用无dsRNA的T7RNA聚合酶进行体外扩增反应,获取无dsRNA的前体RNA;前体RNA进行环化得到粗制环状RNA;利用poly(A)或poly(U)聚合酶处理粗制环状RNA,对其中的线性RNA增加poly(A)或poly(U)长尾;利用亲和层析柱纯化得到高纯环状RNA。技术研发人员:梅英武,魏璐璐,张梦娟受保护的技术使用者:郑州大学技术研发日:技术公布日:2025/1/6本文地址:https://www.jishuxx.com/zhuanli/20250110/352933.html
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