一种漆酶突变体及其在氧化转化大豆苷元制备聚黄酮中的应用

本发明属于生物，具体涉及一种漆酶突变体及其在氧化转化大豆苷元制备聚黄酮中的应用。

背景技术：

1、漆酶（laccase），作为一种含铜多酚氧化酶，又被称为酚酶，是蓝色多铜氧化酶家族（mco）中的成员之一。漆酶能够借助铜离子的强氧化还原能力，有效氧化酚类及芳香类化合物，同时将分子氧还原为水。漆酶能够催化的底物非常宽泛，并且能够直接作用于多种酚类有毒物质及一些芳香类有害物质进行氧化降解。此外，漆酶还可以通过抽取底物中的电子产生自由基进而使小分子物质发生偶联。因此，漆酶在工业生产中，例如在食品加工、污水处理、生物传感器和生物转化等方面均有较多应用。

2、大豆苷元（daidzein），主要源自豆科植物，其结构骨架由两个苯环（a和b环）通过一个杂环吡喃环（c环）连接形成母核。作为天然多酚化合物，大豆苷元具有包括抗氧化活性、抗菌活性、抗ab聚集活性等多种生物活性。目前药物的开发大多基于天然小分子化合物，因此通过对现有小分子化合物进行加工修饰及生物转化以提升其活性具有较高的意义。

3、一般来说，寡聚体的活性相较于其单体会有一定程度的提高。目前为止，仅报道了一种大豆异黄酮苷元的寡聚体，该寡聚体是由氧化酶如辣根过氧化酶和漆酶催化两分子大豆苷元单体聚合形成的双黄酮化合物。因此可对天然漆酶进行改造以筛选获得对大豆苷元转化率较高的突变体，并利用其氧化大豆苷元获得生物活性相较于单体提升的转化产物多聚大豆苷元（poly (daidzein)）。

技术实现思路

1、针对现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种漆酶突变体及其在氧化转化大豆苷元制备聚黄酮中的应用。本发明以灰盖鬼伞（ c. cinerea）的漆酶lcc5为出发酶，通过结构模拟、分子对接、定点突变等策略，获得突变基因。含有突变基因的表达菌经诱导表达后，获得对大豆苷元转化活性提升的突变体lcc5-t485e。突变酶lcc5-t485e在氧化转化大豆苷元中具有潜在应用价值：在40u/ml酶活条件下（以abts测得），1 h内lcc5-t485e可氧化转化88%的大豆苷元，而出发酶lcc5仅能氧化转化70%的大豆苷元，突变酶转化率提升至出发酶的1.26倍。

2、本发明漆酶突变体，简记为lcc5-t485e，其氨基酸序列如seq id no:1所示，相较于出发酶lcc5氨基酸序列改变位点如下：第485位的苏氨酸突变为谷氨酸。

3、本发明漆酶突变酶，其氨基酸序列还可以包括序列中的无义突变或同义突变的组合。

4、本发明漆酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如seq id no:2所示。

5、本发明突变质粒，含有如seq id no:2所述的漆酶突变体的编码基因。

6、本发明漆酶突变酶的表达菌株，含有所述突变质粒。

7、所述表达菌株的分类命名为 pichia pastoris gs115/ppic9k(+)lcc5-t485e，已送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为cctcc no：m 20242012，保藏时间为2024年09月20日，保藏地址：中国·武汉·武汉大学。

8、本发明漆酶突变酶表达菌株的构建方法，包括如下步骤：

9、以灰盖鬼伞（ c. cinerea）的漆酶lcc5为出发酶，通过同源建模预测其结构，与大豆苷元进行分子对接模拟，推断酶上参与反应的关键位点及其催化机制，并据此设计可促进酶催化反应的突变。确定转化大豆苷元活性可能提升的漆酶lcc5-t485e，构建突变体基因并连入载体ppic9k，将线性化的质粒ppic9k电转化转入表达宿主毕赤酵母 pichia  pastoris gs115，突变基因被整合至毕赤酵母醇氧化酶基因组中，经过平板筛选后，得到含有本发明突变基因的工程菌株。

10、本发明漆酶突变体可由所述表达菌株发酵获得。

11、本发明漆酶突变体在大豆苷元氧化转化制备寡聚体化合物中的应用。

12、在ph 8.0、40℃、150 r/min的恒温水浴摇床反应1 h，40u（以abts测得）突变酶lcc5-t485e对0.5mg大豆苷元的氧化转化率为88%，出发酶lcc5的氧化转化率为70%，突变酶的氧化转化率较出发酶提高了26%。

13、本发明获得的寡聚体化合物在制备抗氧化制剂中的应用。

14、本发明获得的寡聚体化合物在制备a-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

15、本发明获得的寡聚体化合物在制备抑菌制剂中的应用。

16、本发明使用漆酶突变体lcc5-t485e对大豆苷元进行转化获得产物，随后通过旋蒸、复溶离心、旋蒸、复溶离心及冷冻干燥对产物进行纯化。转化产物相较于大豆苷元单体具有更好的生物活性：三种常见检测抗氧化活性的方法（dpph法、abts法和frap法）的检测结果均显示转化产物相较于大豆苷元的抗氧化活性显著提升，如图5所示。a-葡萄糖苷酶被认为是餐后血糖升高的关键因素之一，抑制其活性是2型糖尿病重要的治疗策略之一，转化产物相较于大豆苷元使a-葡萄糖苷酶的酶活显著降低，如图6所示。抑菌实验表明，转化产物相较于大豆苷元对于金黄色葡萄球菌具有更显著的抑制活性，如图7所示。

17、本发明对突变酶和出发酶的温度适应性、比酶活和乙醇适应性进行了测定和比较。结果显示，与出发酶相比，突变体的最适温度变高。且突变酶的比酶活也得到了提升，约提高至出发酶的1.92倍。与出发酶相比，突变体的乙醇适应性也有一定程度提高，lcc5的乙醇半抑制浓度约为15%-20%，而突变体的乙醇半抑制浓度提高至20%-25%。

技术特征：

1.一种漆酶突变体，简记为lcc5-t485e，其氨基酸序列如seq id no:1所示。

2.权利要求1所述漆酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如seq id no:2所示。

3.一种突变质粒，含有如权利要求2所述的编码基因。

4.权利要求1所述漆酶突变体的表达菌株，含有权利要求3所述的突变质粒。

5.权利要求1所述漆酶突变体的表达菌株，其特征在于：

6.权利要求1所述漆酶突变体在大豆苷元氧化转化制备寡聚体化合物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

8.根据权利要求6或7制备获得的寡聚体化合物在制备抗氧化制剂中的应用。

9.根据权利要求6或7制备获得的寡聚体化合物在制备a-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

10.根据权利要求6或7制备获得的寡聚体化合物在制备抑菌制剂中的应用。

技术总结本发明公开了一种漆酶突变体及其在氧化转化大豆苷元制备聚黄酮中的应用。本发明以灰盖鬼伞（Coprinopsis cinerea）的漆酶Lcc5为出发酶，通过分子对接，分析位置结构，设计突变。合成突变基因，构建突变基因的重组表达工程菌。含有突变基因的工程菌诱导表达后，经分离纯化获得Lcc5突变体Lcc5‑T485E，该突变体的比酶活及乙醇耐受性有所提升，在使用同等酶活下对大豆苷元的转化率约提高至1.26倍；所获得的转化产物的抗氧化活性、抑酶活性及抑菌活性也显著提升。该突变酶在氧化转化大豆苷元提高其生物价值中具有潜在应用价值。技术研发人员：张学成,李曙光,曾旭诺,房伟,肖亚中受保护的技术使用者：安徽大学技术研发日：技术公布日：2025/1/6