一种固相多肽合成的方法和装置与流程

本技术涉及多肽化学合成，特别是涉及一种固相多肽合成的方法和装置。

背景技术：

1、流动化学(flow chemistry)，又被称为连续流动化学，指化学反应试剂的添加、混合、反应、分离纯化等步骤在连续流动的系统中完成；试剂添加、混合、反应、分离纯化等是连续进行的，是区别传统批次化学(batch chemistry)的一种合成技术。流动化学通常使用微通道芯片、线圈、填充床等作为反应器。

2、填充床反应器(packed bed reactor，pbr)，又称固定床反应器，是流动化学技术中的一类重要反应器。这类反应器通常将固相不溶组分填充于反应器内，并用筛板封装；然后连续通入其它反应组分溶液，使其它反应组分溶液连续通过填充固相组分，并在一定反应条件下实现化学反应。

3、多肽是生物体内一类重要的活性物质，是由两个或两个以上氨基酸通过肽键共价连接形成的聚合物。多肽的合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。大部分多肽分子都是通过化学合成获取的，并且应用最多的是固相合成方法，即固相多肽合成(solid phase peptide synthesis，简写为spps)。

4、固相多肽合成是由美国科学家bruce merrifield于1963年首次提出的多肽合成方法。这种方法首先采用一个适合的固相载体，通常是一种树脂，并将第一个氨基酸固定在载体上；然后脱去保护基团，将下一个保护氨基酸与第一个氨基酸的残基反应并形成肽键；再然后脱去第二个氨基酸的保护基团，再连接下一个氨基酸，通过上述循环重复操作，使肽链增长以达到所需的肽链长度；最后将肽链从树脂上裂解下来，分离纯化，获得目标多肽。

5、固相多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从c端向n端合成。因此，固相多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，一般遵循缩合-洗涤-去保护-洗涤-下一轮缩合的重复操作。合成多肽的过程中，每增加一个氨基酸需要4步：第一步缩合，向末端裸露氨基的树脂中添加缩合试剂、带保护氨基酸和碱，使树脂末端的氨基和带保护氨基酸的羧基行成肽键；第二步清洗，向缩合后的反应体系里多次加入溶剂，并过滤，除去树脂以外的残留试剂；第三步脱保护，向树脂中加入脱保护试剂，去除末端氨基的保护基，以便进行下一个氨基酸的缩合反应；第四步清洗，向反应体系中多次加入溶剂，并过滤，除去树脂以外的残留试剂。

6、由于合成过程存在大量的重复操作，会耗费大量的人力和时间，合成工作者希望利用自动化仪器代替人工操作以节约人力时间成本，即多肽合成仪。多肽合成仪经过了数十年的发展，目前应用最广泛的第三代多肽合成仪，无死角多肽合成仪。

7、但是，无论是人工的固相多肽合成，还是多肽合成仪；都存在难以克服的缺陷，即在合成多肽的四步反应中，第一步缩合和第三步脱保护的反应效率较低，需要较长的反应时间，通常都在半小时以上；并且，氨基酸缩合和脱保护反应不彻底，每接上一个氨基酸的平均产率较低，导致合成多肽产物纯度较低。

8、因此，如何提高固相多肽合成的反应效率和产率，仍然是固体多肽合成技术领域的研究重点和难点。

技术实现思路

1、本技术的目的是提供一种改进的固相多肽合成的方法和装置。

2、为了实现上述目的，本技术采用了以下技术方案：

3、本技术的一方面公开了一种固相多肽合成的方法，包括将填充有多肽合成的固相载体的填充床反应器放置于液体介质中，对液体介质进行控温，并施加超声波场；在控温和超声波场条件下，采用连续注液的方式，向填充床反应器内依序注入用于多肽合成的试剂，进行连续的固相多肽合成。

4、可以理解，本技术的关键在于多肽的固相合成，至于多肽合成后，将其从固相载体上切割下来的方式，可以参考现有技术。本技术的一种实现方式中，完成最后一个氨基酸的偶联后，采用tfa在常温下将肽链从固相载体上裂解下来，获得多肽溶液；然后，对多肽溶液进行浓缩，获得浓缩液，将浓缩液滴入冰乙醚中得到悬浊液，对悬浊液进行离心获得沉淀，即获得多肽。

5、需要说明的是，本技术的固相多肽合成方法，采用流动化学的连续注液方式进行固相多肽合成，并且，整个反应过程在超声波场辅助和温控下进行，有效的提高多肽合成的速度，例如本技术的一种实现方式中，使多肽缩合反应时间缩短至2分钟以内，氨基酸脱保护时间缩短至3分钟以内，比现有的相同规格的固相多肽合成方法快10倍以上，提高了多肽固相合成的生产效率。并且，通过超声波场辅助多肽合成，还有效的提高了多肽合成反应传质传热效率，提高了目标多肽的纯度，提高了每个氨基酸的平均偶联产率，例如本技术的一种实现方式中，每个氨基酸的平均偶联产率可以高达99％以上。

6、本技术的一种实现方式中，填充床反应器具有中空腔体，中空腔体两端分别设置有溶液入口和溶液出口，在溶液入口和溶液出口分别放置5-50μm孔径的筛板，两端筛板之间的空腔装填多肽合成的固相载体。

7、本技术的一种实现方式中，超声波场的超声波频率为25khz-80khz。例如，具体的超声波频率可以为25khz、30khz、35khz、40khz、45khz、50khz、55khz、60khz、65khz、70khz、75khz或80khz；具体的可以根据反应条件和填充床反应器的规格而定。

8、本技术的一种实现方式中，超声波场的超声波频率优选为30-50khz。

9、本技术的一种实现方式中，超声波场的功率密度为0.5-5.0w/cm2。

10、需要说明的是，本技术的固相多肽合成方法中，超声波场的功率密度不能太高也不能太低，超声波场的功率密度太低，例如低于0.5w/cm2，则辅助提高反应速度的效果较差；超声波场的功率密度太高，例如高于5.0w/cm2，则能耗大，且对装置的损耗也大。因此，优选地超声波场的功率密度为0.5-5.0w/cm2，且超声波场的超声波频率优选为30-50khz。

11、本技术的一种实现方式中，液体介质为水。

12、需要说明的是，液体介质的作用主要是进行控温和超声波场的传导，水只是一种比较安全、廉价且易获取的液体介质，不排除还可以采用其他液体介质。

13、本技术的一种实现方式中，恒温的温度为40-95℃。例如，恒温控制的温度可以为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃或95℃。

14、本技术的一种实现方式中，控温温度优选为55-95℃，更优选为65-85℃。

15、需要说明的是，对于固相多肽合成，一般认为，提高反应温度可以加快反应速度，但反应温度太高容易产生更多的副产物；因此，比较保守和安全的固相多肽合成温度为20-35℃。但是，本技术研究发现，采用流动化学进行固相多肽合成时，控制恒温热浴的温度为40-95℃，优选为55-95℃，更优选为65-85℃，并辅助超声波场，既能够提高反应速度，又能够确保每个氨基酸的平均偶联产率，提高目标多肽的纯度。

16、本技术的一种实现方式中，控温允许的温度波动范围为±2℃，优选为±1.5℃，更优选为±1℃。

17、需要说明的是，控温允许的温度波动是指，在进行恒温热浴时，虽然理论上设置为恒温条件，但是，实际上允许热浴温度在该设置温度上有一定的波动。本技术的固相多肽合成方法中，温度波动范围在±2℃都能够满足使用需求；当然，更优的温度波动范围为±1.5℃，更优选为±1℃，温度波动范围越小，对装置的要求越高，相应的对反应的控制也更准确。

18、本技术的一种实现方式中，连续注液的方式包括依次不间断的向填充床反应器中循环注入试剂，同时，试剂连续从填充床反应器的溶液出口排出。

19、本技术的一种实现方式中，多肽合成的试剂包括偶联试剂、清洗试剂和脱保护试剂。

20、本技术的一种实现方式中，向填充床反应器内依序注入用于多肽合成的试剂，具体包括，不间断的向填充床反应器中按照偶联试剂、清洗试剂、脱保护试剂、清洗试剂的顺序连续循环注入试剂。

21、本技术的一种实现方式中，偶联试剂以1-5ml/min的流速持续注入填充床反应器内。

22、本技术的一种实现方式中，持续注入偶联试剂的时间为0.5-10分钟。

23、需要说明的是，持续注入偶联试剂的时间，实际上就是氨基酸缩合的时间，采用本技术的固相多肽合成方法，该时间仅仅只需要0.5-10分钟即可，其时间长短主要取决于合成多肽的量，例如对于合成0.1毫摩尔多肽，通常只需要3分钟即可，合成多肽的量越大所需时间越长。但是，总的来说，对于相同规格的多肽而言，例如对于同样是合成0.1毫摩尔多肽的规格，本技术方法只需要3分钟即可完成氨基酸缩合，而现有方法通常需要更长的时间，甚至有的反应需要半小时以上。

24、本技术的一种实现方式中，脱保护试剂以1-5ml/min的流速持续注入填充床反应器内。

25、本技术的一种实现方式中，持续注入脱保护试剂的时间为0.5-10分钟。

26、需要说明的是，持续注入脱保护试剂的时间，实际上就是树脂或氨基酸脱保护的时间，采用本技术的固相多肽合成方法，该时间仅仅只需要0.5-10分钟即可，其时间长短主要取决于合成多肽的量，例如对于合成0.1毫摩尔多肽，通常只需要2分钟即可，合成多肽的量越大所需时间越长。但是，总的来说，对于相同规格的多肽而言，例如对于同样是合成0.1毫摩尔多肽，本技术方法只需要2分钟即可完成脱保护反应，而现有方法通常需要更长时间，有的甚至需要半小时以上。

27、本技术的一种实现方式中，清洗试剂以10-100ml/min的流速持续注入填充床反应器内。

28、本技术的一种实现方式中，偶联试剂含有氨基酸、缩合试剂、碱和溶剂；其中，氨基酸的用量为2-8当量，碱的用量为2-8当量，并且每个循环按照合成多肽的氨基酸顺序替换偶联试剂中的氨基酸。

29、需要说明的是，现有技术中，为了确保合成速度和目标多肽的产率，通常需要采用更高当量的氨基酸，例如采用10当量甚至更高当量的氨基酸；本技术的方法，通过设计的填充床反应器，在超声波场辅助和恒温40-95℃，优选为55-95℃，更优选为65-85℃，能够实现在确保目标多肽产率的情况下，采用更低当量的氨基酸。这样不仅能够有效的降低原材料成本，也能够降低副产物的产生，提高目标多肽的纯度。

30、本技术的一种实现方式中，偶联试剂中的碱为diea、dipea、nmm、et3n、dbu中的至少一种。

31、本技术的一种实现方式中，脱保护试剂含有碱和溶剂，其中，碱的用量为4-20当量。

32、本技术的一种实现方式中，脱保护试剂中的碱为哌啶、乙二胺、环己胺、吗菲林、dbu中的至少一种。

33、本技术的一种实现方式中，清洗试剂为dcm、dmf、dmso、nmp、thf、py中的至少一种；偶联试剂和脱保护试剂中的溶剂为dcm、dmf、dmso、nmp、thf、py中的至少一种。

34、需要说明的是，本技术的关键在于，填充床反应器的设计以及超声波场辅助和恒温控制，至于偶联试剂、清洗试剂、脱保护试剂、清洗试剂，以及树脂的溶胀溶剂都可以参考现有技术。例如，本技术优选的实现方案中，树脂溶胀溶剂为dcm、dmf、dmso和nmp中的至少一种；偶联试剂含有氨基酸、缩合试剂、碱和溶剂，其中，缩合试剂为dcc、dic、hatu、hbtu、hctu、tatu、tbtu、comu、pyaop、pybop、bop、hoat、hobt等中的至少一种，氨基酸是20种天然氨基酸或非天然氨基酸中的一种。

35、本技术的一种实现方式中，固相载体为固相树脂。

36、需要说明的是，固相树脂只是本技术的一种实现方式中采用的固定多肽的载体；可以理解，在相同的发明构思下，不排除还可以采用其他的固相载体，不仅限于固相树脂。

37、本技术的一种实现方式中，在向填充床反应器内依序注入用于多肽合成的试剂之前，还包括，在控温和超声波场条件下，采用连续注液的方式，向填充床反应器内依次注入溶胀和脱保护试剂，对树脂进行溶胀和脱保护。

38、本技术的另一面还公开了一种固相多肽合成的装置，包括填充床反应器和超声波槽；填充床反应器包括中空的反应腔体，反应腔体内放置有多肽合成的固相载体，反应腔体的上端设置有顶部筛板，反应腔体的下端设置有底部筛板，顶部筛板和底部筛板将固相载体封装在反应腔体内；并且，顶部筛板和底部筛板仅允许溶液通过，而不允许固相载体通过；填充床反应器的顶部开设有溶液入口，用于溶液注入反应腔体内；填充床反应器的底部开设有溶液出口，用于溶液从反应腔体内流出；超声波槽的侧壁上安装有超声发生器，超声波槽用于容纳液体介质和填充床反应器。

39、使用时，填充床反应器放置于超声波槽内，超声波槽内装有液体介质，通过超声发生器产生均匀的超声波场，并通过液体介质将超声波场传导给填充床反应器，使整个固相多肽合成过程都在超声波条件下进行。

40、本技术的一种实现方式中，超声波槽内还安装有温控装置，温控装置包括加热器、温度传感器和控制器；加热器用于提供恒温加热；温度传感器用于实时监控超声波槽内的温度；控制器用于根据温度传感器监控的温度实时开启或关闭加热器，从而控制超声波槽内的温度。

41、使用时，填充床反应器放置于超声波槽内，超声波槽内装有液体介质，通过加热装置和超声发生器形成恒温热浴和超声波场的复合反应条件，并通过液体介质传导给填充床反应器，使整个固相多肽合成过程都在恒温和超声波场条件下进行。

42、本技术的一种实现方式中，固相载体为固相树脂。

43、本技术的一种实现方式中，超声波槽内的液体介质为水。

44、本技术的一种实现方式中，填充床反应器的顶部具有反应器顶盖，用于将顶部筛板、固相载体和底部筛板固定在反应腔体内。

45、本技术的一种实现方式中，顶部筛板和底部筛板的孔径为5-50μm。

46、由于采用以上技术方案，本技术的有益效果在于：

47、本技术的固相多肽合成方法，采用流动化学技术路线和填充床反应器，通过超声波辅助和控温，可以实现快速合成多肽，不仅提高多肽合成的速度，缩短了多肽缩合反应的时间和氨基酸脱保护的时间，从而提高多肽固相合成的生产效率；而且，通过超声波辅助，提高了多肽合成过程中的传质传热效率，提高了每个氨基酸的平均偶联产率，提高了目标多肽的纯度。