一种膜结合磷酸糖基转移酶的无细胞表达方法

本发明涉及蛋白质合成，具体涉及一种膜结合磷酸糖基转移酶的无细胞表达方法。

背景技术：

1、微生物胞外多糖不仅有助于细胞间的相互吸附和识别作用、对外界极端环境的应激反应、吸附外源有机或无机化合物；更重要的是，胞外多糖的优良流变性、乳化性和絮凝活性，赋予了其免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等特殊的生物活性。因此，微生物胞外多糖重要的医学价值和工业用途引起了人们的广泛关注。

2、微生物胞外多糖及糖缀合物(糖脂、糖蛋白)的生物合成依赖于磷酸糖基转移酶来启动糖重复单元或糖缀合物前体的组装。在磷酸糖基转移酶的作用下，糖核苷酸和脂载体(und-p)形成und-pp-糖。磷酸糖基转移酶分为两个家族：聚异戊二烯基磷酸n-乙酰氨基糖-1-磷酸转移酶(pnpt)和聚异戊二烯基磷酸己糖-1-磷酸转移酶(phpt)。然而，由于磷酸糖基转移酶是一种整合膜蛋白，其疏水结构域使其难以在大肠杆菌等生物体内过表达，如何获得纯度高、稳定性好的膜蛋白仍然是表征磷酸糖基转移酶的重大挑战，一定程度上限制了研究人员对微生物胞外多糖生物合成机制的解析和对糖分子组成的调控。

3、传统膜结合磷酸糖基转移酶表达方法是通过融合分子伴侣或sumo、trxa等促溶标签于大肠杆菌等胞内表达体系进行表达(protein expression and purification 207(2023)106273、glycobiology,2012,22(1):116–122)，而后使用ddm、triton x-100、chaps等系列表面活性剂从膜中提取或重构胞内表达的不溶性蛋白沉淀(journal ofbiological chemis try,2023,299(10):105194、antimicrobial agents andchemotherapy,2017,61(11):e01310-17、mbio,2023,14(5):e00948-23.)，从而将其溶解至洗涤剂胶束中，获得可溶性蛋白样品。尽管如此，目前对膜结合磷酸糖基转移酶的功能研究与晶体结构解析仍然非常困难。这主要是由于膜蛋白过表达易引起细胞毒性，其表达量及纯度尚未达到结构分析的要求；而且并非所有的表面活性剂所形成的胶束均能在体外重构或在体内提取磷酸糖基转移酶，并使其具备相应功能活性，这一过程仍需对促溶标签或表面活性剂进行冗杂的筛选与优化过程。因此，传统研究手段对实现膜结合磷酸糖基转移酶的功能性表达尚存在明显的局限性，亟需寻找一种实现膜结合磷酸糖基转移酶可溶性表达的高效方法。

4、近年来，随着合成生物技术的进步，基于细胞提取物的无细胞蛋白合成(cell-free protein synthesis，cfps)系统成为有望替代胞内系统的开放式蛋白质表达系统，在外源补充能量体系、氨基酸、辅因子、基因模板等必须物质的情况下可于体外实现中心法则，控制基因转录与蛋白质翻译，数小时内即可实现目标蛋白的高效合成。与传统的基于胞内的表达体系相比，cfps不仅操作简便、效率高，还突破了蛋白合成与细胞活性之间关系的瓶颈，为膜蛋白的功能性表达提供了一种新的途径。

5、目前，基于表面活性剂的模式(detergent based cell-free，dcf)和基于脂质的模式(lipid based cell-free，lcf)以被应用于cfps系统中表达膜蛋白，使目的膜蛋白以可溶形式与胶束或脂质体共翻译。dcf模式在组装cfps反应体系时直接补充表面活性剂，膜蛋白可利用其形成的胶束稳定其疏水结构域；而lcf模式则补充纳米脂质体、纳米磷脂盘等脂质膜组件，使膜蛋白疏水结构域整合于磷脂双分子层结构中。friederike junge于无细胞体系中补充0.5％brij35，以dcf模式成功获得内皮素受体a的可溶性蛋白样品(journalof structural biology,2010,172(1):94–106)；ke yue则制备了一种脂质体，以lcf模式实现水通道蛋白aqpz的可溶性表达(cells,2019,8(11):1325.)；michael c.jewett团队以ddm、triton x-100以及popc纳米磷脂盘作为人工疏水材料，以dcf或lcf模式于cfps系统中获得可溶性寡糖基转移酶cjpglb(biotechnology and bioengineering,2018,115(3):739–750.)。

6、然而，目前使用cfps系统制备磷酸糖基转移酶的研究鲜有报道。这主要是由于cfps系统中缺乏生物膜环境，还需针对磷酸糖基转移酶这一特定蛋白进行膜增强型系统改造。此外，不同膜蛋白的理化性质差异导致其最适疏水材料的不同，加之商业化纳米磷脂盘的成本较高，限制了该技术在磷酸糖基转移酶体外制备的进一步应用。

7、因此，筛选合适的疏水材料，并建立适用于膜结合磷酸糖基转移酶可溶性表达的无细胞蛋白合成系统至关重要。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种膜结合磷酸糖基转移酶的无细胞表达方法，解决目前膜结合磷酸糖基转移酶合成过程中表达效率较低、溶解性能不佳、难以折叠成活性口袋系列难题。

2、为了实现上述目的，本发明的实施例在提出了一种膜结合磷酸糖基转移酶的无细胞表达方法，其包括以下步骤：

3、构建含编码膜结合磷酸糖基转移酶基因gtp或epsl的重组质粒；

4、制备纳米脂质体；

5、制备大肠杆菌rosetta(de3)细胞提取物；

6、将所述重组质粒加入到包含所述大肠杆菌rosetta(de3)细胞提取物、反应缓冲液的无细胞表达体系中，同时将表面活性剂或纳米脂质体作为人工疏水材料补充至所述无细胞表达体系，混匀后至于20～30℃恒温摇床中孵育8～12h，以实现gtp或epsl膜结合磷酸糖基转移酶的高效可溶性表达。

7、根据本发明实施例的一种膜结合磷酸糖基转移酶的无细胞表达方法，以基于大肠杆菌rosetta(de3)细胞提取物的膜增强型无细胞系统作为重要蛋白合成平台，数小时内即可于1.5ml ep管中实现膜结合磷酸糖基转移酶gtp、epsl的可溶性表达，大大减少了获得膜结合磷酸糖基转移酶的时间成本、简化了其生产工艺，有效避免传统方法表达过程繁琐、表达量低等问题，不仅为膜蛋白的高效可溶性表达提供了新方法，也为膜结合磷酸糖基转移酶的晶体结构解析与功能研究奠定了基础。

8、另外，根据本发明上述实施例提出的一种膜结合磷酸糖基转移酶的无细胞表达方法，还可以具有如下附加的技术特征：

9、可选地，膜结合磷酸糖基转移酶gtp的氨基酸序列如seq id no.1所示；膜结合磷酸糖基转移酶epsl的氨基酸序列如seq id no.2所示。

10、可选地，构建含编码膜结合磷酸糖基转移酶基因gtp或epsl的重组质粒的步骤为：

11、以地衣芽孢杆菌cgmcc 2876基因组为模板，pcr扩增膜结合磷酸糖基转移酶基因gtp、膜结合磷酸糖基转移酶基因epsl，将pcr扩增产物与线性化pivex 2.4c载体通过gibson组装进行连接，转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，筛选重组子进行测序，获得pivex2.4c-gtp重组质粒、pivex2.4c-epsl重组质粒。

12、进一步，pcr扩增膜结合磷酸糖基转移酶基因gtp使用的引物如seq id no.3、seqidno.4所示；pcr扩增膜结合磷酸糖基转移酶基因epsl使用的引物如seq id no.5、seqidno.6所示。

13、可选地，所述纳米脂质体的制备包括：

14、将磷脂和胆固醇溶解于有机溶剂中，通过旋转蒸发形成脂质薄膜，去除有机溶剂后加入磷酸盐缓冲液，于45℃下搅拌水合1h，收集脂质悬液后，立即通过超声能量和机械能的联合作用减小脂质体粒径，获得纳米脂质体。

15、进一步，所述有机溶剂为氯仿和甲醇，比例为3:1；所述磷脂和所述胆固醇的比例为4:1；所述磷酸盐缓冲液加入量为：每20mg磷脂加入1ml磷酸盐缓冲液。

16、进一步，通过超声能量和机械能的联合作用为：使用20％的功率，超声10min后立即通过含100～200nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出机21～31次。

17、可选地，所述反应缓冲液的组分为hepes、atp、ctp、gmp、ump、辅酶a、trna、亚叶酸、亚精胺、谷氨酸钾、谷氨酸镁、二硫苏糖醇、三磷酸甘油酸、多种氨基酸、烟酰胺二核苷酸、peg6000。

18、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。