一种抗人补体C5的单域抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗人补体c5的单域抗体及其应用。

背景技术：

1、补体（complement，c）系统是先天免疫系统和适应性免疫系统的重要组成部分，其作为宿主防御和监视系统的作用必不可少，主要由肝脏产生的血浆蛋白或在细胞表面表达的膜蛋白组成。补体大约含有30余种组分，广泛存在于血清、组织液和细胞膜表面，一般情况下，血浆中多数补体成分仅在被激活后才具有生物学功能。补体激活可以快速保护机体免受感染性攻击，传统上被认为是宿主防御入侵病原体和清除潜在破坏性细胞碎片的核心部分，但值得注意的是，其也可以成为众多炎症或自身免疫性疾病中的驱动因素或恶化因素。事实上，过度或失调的补体激活与多种疾病的发病机制有关，包括眼部病变、急性炎症（败血症和缺血性中风等）和慢性疾病（包括自身免疫性疾病、神经退行性疾病、肾脏疾病和具有血栓炎症特征的慢性溶血性疾病等）。

2、补体可以通过3条既独立又交叉的通路产生一系列丝氨酸蛋白酶的级联酶解激活，包括经典途径、旁路途经和凝集素途径，虽然这些激活产物不一定是炎症紊乱的起始因素，但它们似乎是促进和延续炎症反应的原因，特别是补体c5，处于级联反应末端，正常人血清中约含有38~90mg/l，该蛋白质由二硫键连接的α和β多肽链组成，分子量190kda，其中α链为115kda，β链为75kda，在血清中被发现是一种失活的蛋白质，但可以被两种不同的c5转化酶（c4bc2ac3b或c3bbbc3b）中的一种裂解成两种活性肽（c5a和c5b）。其中c5a是补体激活产物中是最有效的炎症肽之一，具有强大的功能。c5a主要通过两种已鉴定的c5a受体c5ar和c5l2发挥作用，c5ar属于视紫红质家族（rhodopsin family）的g蛋白偶联受体，具有七个跨膜片段；而c5l2在结构上是同源的，但缺乏g蛋白偶联。c5a的产生与包括病毒感染、哮喘、动脉粥样硬化、自身免疫性关节炎和败血症等疾病相关。有研究发现炎症性疾病患者的血清中c5a水平升高，其过度的补体激活可能会影响数亿人的健康。

3、c3和c5的裂解都会导致过敏毒素产生，并允许膜攻击复合物的形成，都是疾病的主要驱动因素，靶向c3和c5是最早考虑的治疗方法之一。而且c5处于级联反应末端，靶向其可以调控所有3种不同通路激活的补体信号，因此c5成为补体药物研发的热门靶点。而目前作用于c5的治疗药物大部分是通过注射的抗c5抑制剂，主要通过阻断c5的活性进行治疗，如cn105324485a公开了使用irna例如双链核糖核酸(dsrna)、靶向补体组分c5基因的组合物以及使用此种irna(例如dsrna)、组合物来抑制c5的表达并且治疗患有一种补体组分c5相关联的疾病。cn101970002a公开了给予对象有效量的抗因子bb抗体以选择性抑制补体旁路活化产物c3a、c5a和c5b-9的形成，和抑制中性粒细胞、单核细胞和血小板的活化。

4、免疫吸附疗法作为近年来新兴的新技术，是将高度特异性的抗原或抗体与吸附材料（载体）结合，制成吸附剂（柱），利用其特异性吸附性能，选择性或相对特异性地清除患者血液中内源性致病因子，达到缓解病情的目的。

5、与传统抗体相比，单域抗体是一种由抗体的单个可变域构成的抗体形式，类型为重链抗体（vhh区域），只有一个具有二硫键的结构域，折叠成相对稳定的结构，有研究表明单域抗体在37℃孵育一周后仍保持抗原结合能力，使其在治疗或修饰过程中可以使用更苛刻的化学和物理条件。此外，单域抗体体积小，有利于减少潜在免疫原性表位的数量，同时具有快速的血液清除率和抵抗形成聚集体的能力，只引起较低的免疫原性。单域抗体已经在诊断和治疗等不同的生物技术领域作为工具显示出巨大的潜力。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种抗人补体c5的单域抗体及其应用。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一个方面，提供：一种抗人补体c5蛋白的单域抗体，由框架区fr1～fr4和抗原结合区cdr1～cdr3组成，其cdr1～cdr3的氨基酸序列选自如下的一组：

4、组1，其cdr1～cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.3～seq id no.5所示；

5、组2，其cdr1～cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.6～seq id no.8所示。

6、在一些单域抗体的实例中，其fr1～fr4的氨基酸序列选自如下的一组：

7、组1，其fr1～fr4的氨基酸序列分别如seq id no.9～seq id no.12所示；

8、组2，其fr1～fr4的氨基酸序列分别如seq id no.13、seq id no.10、seq idno.14和seq id no.12所示。

9、在一些单域抗体的实例中，其特异性结合补体c5。

10、在一些单域抗体的实例中，其为嵌合抗体、人源化抗体、融合fc片段的单域抗体、二价或多价单域抗体。

11、本发明的第二个方面，提供：一种核酸分子，编码本发明第一个方面所述的单域抗体。

12、本发明的第三个方面，提供：一种表达载体，包含本发明第二个方面所述的核酸分子。

13、本发明的第四个方面，提供：一种宿主细胞，其表达本发明第一个方面所述的单域抗体，或包括本发明第二个方面所述的核酸分子，或含有本发明第三个方面所述的表达载体。

14、本发明的第五个方面，提供：本发明第一个方面所述单域抗体的应用，所述应用包括：

15、制备补体c5的吸附剂；

16、制备补体c5的检测试剂；

17、制备治疗和/或预防补体c5异常所引起的疾病的药物。

18、在一些应用的实例中，所述吸附剂通过将本发明第一个方面所述的单域抗体偶联在固相载体上得到。

19、在一些应用的实例中，补体c5异常所引起的疾病包括阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)、非典型溶血性尿毒症综合征(ahus)、哮喘、类风湿性关节炎(ra)；抗磷脂抗体综合征；狼疮肾炎；缺血-再灌注损伤；典型的或感染性溶血性尿毒症综合征(thus)；致密沉积物病(ddd)；视神经脊髓炎(nmo)；多灶性运动神经病(mmn)；多发性硬化(ms)；黄斑变性(例如，年龄相关的黄斑变性(amd))；溶血、肝脏酶升高以及血小板低(hellp)综合征；血栓性血小板减少性紫癜(ttp)；自发性流产；寡免疫血管炎；大疱性表皮松解症；习惯性流产；先兆子痫、创伤性脑损伤、重症肌无力、冷凝集素病、皮肌炎大疱性类天疱疮、志贺毒素大肠杆菌相关的溶血性尿毒症综合征、c3肾病、抗嗜中性粒细胞细胞质抗体相关联的血管炎、体液和血管移植排斥、移植物功能异常、心肌梗塞、异源移植、脓毒症、冠状动脉病、皮肌炎、格雷夫斯病、动脉粥样硬化、阿耳茨海默氏病、全身性炎症反应脓毒症、脓毒性休克、脊髓损伤、肾小球性肾炎、桥本氏甲状腺炎、i型糖尿病、牛皮癣、天疱疮、自身免疫性溶血性贫血(aiha)、itp、肺出血肾炎综合征、德戈斯病、抗磷脂综合征(aps)、灾难性aps(caps)、心血管病症、心肌炎、脑血管疾病、外周血管疾病、肾血管疾病、肠系膜/肠血管疾病、血管炎、亨诺赫-舍恩莱因紫癜肾炎、全身性红斑狼疮相关联的血管炎、与类风湿性关节炎相关联的血管炎、免疫复合物血管炎、高安氏病、扩张性心肌病、糖尿病性血管病、川畸氏病(动脉炎)、静脉气体栓子(vge)以及支架放置、旋转式动脉粥样斑块去除术、膜性肾病、格-巴二氏综合征和经皮穿刺冠状动脉成形术(ptca)后的再狭窄。

20、本发明的有益效果是：

21、本发明一些实例的单域抗体，对人补体c5吸附的特异性高，为治疗补体c5异常引起的疾病提供了新的方向。