一种宽体金线蛭失稳酶融合蛋白及其应用

本发明涉及生物，具体涉及一种宽体金线蛭来源的失稳酶融合蛋白及其应用。

背景技术：

1、宽体金线蛭(whitmania pigra whitman)隶属于无吻蛭目，黄蛭科，金线蛭属，是中药材水蛭的基原动物之一，具有较大的药用价值，在我国分布广泛，常年栖息于水田及与其相同的沟渠中，以吸食新鲜螺类体液为生。

2、申请人从宽体金线蛭(w.pigra)唾液腺转录组数据库(srx16840326、srx16840327、srx16840328)中筛选到一种具有抑菌和溶血功效水蛭多肽的转录本，通过cdna序列克隆验证了序列的正确性。除去多肽信号肽后，基于pas方法，设计全长拼接引物，合成目的基因，在pet-32a载体的ncoⅰ和xhoⅰ酶切位点插入目的基因，构建了pet32a-trx-ek-wpdestabilase原核表达体系。经iptg诱导、破碎、纯化，sds-page检测得到n端带有trx等标签的融合目的蛋白，融合目的蛋白的抗菌活性为14.17μg/ml，溶血率为44.06％；详见中国发明专利，申请号：cn202111590989.2；授权公告号：cn114057866b。

3、为了进一步提高宽体金线蛭失稳酶(wpdestabilase)的活性，申请人对wpdestabilase的表达策略进行了优化，获得了抑菌活性和溶栓活性显著提高的融合蛋白。

技术实现思路

1、一方面，本发明提供了一种活性提高的失稳酶融合蛋白，所述失稳酶融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.3或seq id no.5所示。

2、在一个实施方式中，所述失稳酶融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。

3、在一个实施方式中，所述失稳酶融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示。

4、另一方面，本发明还提供了上述失稳酶融合蛋白的编码基因。

5、在一个实施方式中，所述失稳酶融合蛋白的编码基因的序列如seq id no.4所示。

6、在一个实施方式中，所述失稳酶融合蛋白的编码基因的序列如seq id no.6所示。

7、另一方面，本发明还提供了包含上述失稳酶融合蛋白或其编码基因的生物材料。所述生物材料选自：包含上述失稳酶融合蛋白或其编码基因的载体，或者，包含上述失稳酶融合蛋白或其编码基因的宿主细胞。

8、另一方面，本发明还提供了包含上述编码基因的载体，或者，包含所述载体的宿主细胞。

9、在一个实施方式中，所述载体包括克隆载体和表达载体。

10、在一个实施方式中，所述载体为pczn1。

11、在一个实施方式中，所述载体是环状的或线状的。

12、本文所用术语“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指具有外源细胞中掺入和表达异源dna片段的能力的载体。许多原核和真核表达载体可商购获得。选择合适的表达载体是本领域技术人员所熟知的。

13、在一个实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

14、在一个实施方式中，所述原核细胞来源于大肠杆菌或农杆菌。

15、在一个实施方式中，所述真核细胞为酵母。

16、另一方面，本发明还提供了上述失稳酶融合蛋白，或者，包含上述失稳酶融合蛋白或其编码基因的生物材料在溶解血栓和/或抑菌中的应用。

17、另一方面，本发明还提供了上述失稳酶融合蛋白，或者，包含上述失稳酶融合蛋白或其编码基因的生物材料在制备用于溶解血栓和/或抑菌的试剂中的用途。

18、在一个实施方式中，所述抑菌为抑制球菌，例如，黄体微球菌。

19、在一个实施方式中，所述血栓选自新鲜血栓和老化血栓(或称之为，陈旧性血栓)中的一种或任意几种。

20、另一方面，本发明还提供了一种制备上述失稳酶融合蛋白的方法，所述方法包括利用表达载体对上述失稳酶融合蛋白进行表达的步骤。

21、进一步的，所述方法还包括分离/纯化所述失稳酶融合蛋白的步骤。

22、本发明通过对宽体金线蛭来源的失稳酶wpdestabilase表达策略的优化，提高了失稳酶融合蛋白的抑菌活性、溶栓活性和异肽酶活性，提高了wpdestabilase的应用前景和应用空间。

技术特征：

1.一种活性提高的失稳酶融合蛋白，所述失稳酶融合蛋白的氨基酸序列如seq idno.5所示。

2.包含权利要求1所述失稳酶融合蛋白或其编码基因的生物材料。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料选自：包含权利要求1所述失稳酶融合蛋白或其编码基因的载体，或者，包含权利要求1所述失稳酶融合蛋白或其编码基因的宿主细胞。

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述载体包括克隆载体和表达载体。

5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述载体为pczn1。

6.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

7.权利要求1所述的失稳酶融合蛋白或者权利要求2-6任一所述的生物材料在溶解血栓和/或抑菌中的应用。

8.权利要求1所述的失稳酶融合蛋白或者权利要求2-6任一所述的生物材料在制备用于溶解血栓和/或抑菌的试剂中的用途。

9.一种制备权利要求1所述的失稳酶融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括利用表达载体对权利要求1所述的失稳酶融合蛋白进行表达的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括分离/纯化所述失稳酶融合蛋白的步骤。

技术总结本发明公开了一种活性提高的失稳酶融合蛋白，所述失稳酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示，本发明通过对宽体金线蛭来源的失稳酶Wpdestabilase表达策略的优化和序列改造，提高了失稳酶融合蛋白的抑菌活性、溶栓活性和异肽酶活性，提高了Wpdestabilase的应用前景和应用空间。技术研发人员：程搏幸,刘飞,郜天一,张奎,卢昱希受保护的技术使用者：贵州师范学院技术研发日：技术公布日：2025/1/6