一种淋巴组织中B细胞亚群的检测方法

本发明属于生物检测，尤其是涉及一种淋巴组织中b细胞亚群的检测方法。

背景技术：

1、淋巴器官是机体内实现免疫功能的免疫器官，通常按层次结构分类为初级淋巴器官、二级淋巴器官以及三级淋巴器官。初级淋巴器官包括胸腺和骨髓，二级淋巴器官主要包括淋巴结、脾、扁桃体等，三级淋巴器官是在出生后形成的淋巴细胞的聚集体，这些淋巴细胞聚集体可以出现在机体的任何非淋巴组织的慢性炎症部位，如自身免疫性疾病，调节局部组织的免疫反应。在免疫应答过程中，淋巴组织直接暴露于炎性环境，接受刺激抗原和细胞因子的作用，快速产生免疫应答的同时也可能发生过量淋巴细胞活化，进而产生“炎性因子风暴”，这也有可能是自身免疫系统疾病的发病密切相关。

2、自身免疫性疾病是多种因素引起的免疫学功能紊乱，往往伴随着b细胞的功能亢进以及t细胞的功能抑制，同时导致机体对自身抗原产生免疫反应，分泌多种抗体攻击靶器官及组织，从而引起疾病。自身免疫性疾病导致的免疫失衡主要是由于t细胞过度参与了b细胞向浆细胞分化成熟的过程，从而使浆细胞产生了大量的自身抗体。b细胞作为抗体产生细胞的重要来源，在自身免疫性疾病中发挥重要功能，不论在淋巴组织还是在患者外周血中均具有一定的细胞亚群差异，不同的b细胞亚群也在疾病中发挥不同的功能。目前骨髓、外周血及外周淋巴结中b细胞的相关研究已取得一定进展，但b细胞亚群在淋巴组织中的表达及作用机制尚不明确，对于以中枢免疫为核心的自免病研究造成了较大阻碍。

3、现有技术通常采用共聚焦显微技术或多标记免疫荧光染色技术检测组织微环境中的细胞亚群分类情况，虽然可以较为精准地明确某一类多marker的细胞亚群，但传统染色技术存在缺陷，稳定性较差，难以揭示自免病发生过程中淋巴组织中b细胞亚群发挥的重要作用。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种淋巴组织中b细胞亚群的检测方法。

2、本发明采用的技术方案是：一种用于检测淋巴组织中b细胞亚群的试剂盒，包括量子点-抗体cd19偶联体、量子点-抗体cd138偶联体和量子点-抗体cd1d偶联体。

3、优选地，量子点分别为qds-525、qds-585、qds-625。

4、优选地，包括量子点偶联抗体qds-585-cd19、量子点偶联抗体qds-525-cd138、量子点偶联抗体qds-525-cd1d、抗原修复液和dna荧光染液。

5、优选地，将量子点、edc、nhs以摩尔比1:2500-3500:5000-6000混合，对量子点进行活化，将抗体加入到活化量子点溶液中，量子点与抗体摩尔比为1:20-80，反应后得到qds-ab偶联物；取上清为能够用于染色的量子点标记的抗体溶液。

6、一种淋巴组织中b细胞亚群的检测方法，使用用于检测淋巴组织中b细胞亚群的试剂盒；通过不同量子点-抗体偶联物依次对淋巴组织切片中抗体cd19、抗体cd138和抗体cd1d的标记，实现对淋巴组织b细胞亚群的检测。

7、优选地，用于标记b细胞的特定抗体为cd19；用于标记浆细胞的特定抗体为cd19和cd138；用于标记调节b细胞的特定抗体为cd19和cd1d。

8、优选地，先制备淋巴组织切片，使用抗原修复液进行抗原修复，在分别使用不同量子点标记的抗体对组织切片进行染色，再对细胞进行染色，采集组织切片荧光信息，得知检测的淋巴组织中b细胞亚群组成情况。

9、淋巴组织中b细胞亚群的检测方法在非疾病诊断治疗目的研究自身免疫性疾病状态中的应用。

10、优选地，统计量子点荧光强度，计算对应抗体平均荧光强度；当cd19的平均荧光强度大于484.029，提示检测对象自身免疫状态亢进；同时cd138的平均荧光强度大于416.87并且cd1d的平均荧光强度小于85.614，提示检测对象自身免疫亢进程度严重。

11、本发明具有的优点和积极效果是：通过量子点代替荧光染料，能够实现对组织切片的直接标记，实现了对总体b细胞、浆细胞和调节b细胞在淋巴组织中的局部定位，既能够实现数量的检测也能够实现位置的检测，便于明确其生物学行为；

12、通过体外检测患者的淋巴组织中的总体b细胞、浆细胞和调节b细胞的表达情况，从发病机制层面对患者的免疫情况进行评估，克服了以往评估手段较为局限的劣势，更有利于应用于临床淋巴组织相关自身免疫性疾病发病的预测；

13、采用量子点染色对现有的多色免疫荧光技术进行了改进，使用量子点搭载抗体的方法，免去了二抗染色环节，采用直接法标记，并发挥量子点本身的优势，节省实验时间，提高效率。

技术特征：

1.一种用于检测淋巴组织中b细胞亚群的试剂盒，其特征在于：包括量子点-抗体cd19偶联体、量子点-抗体cd138偶联体和量子点-抗体cd1d偶联体。

2.根据权利要求1所述的用于检测淋巴组织中b细胞亚群的试剂盒，其特征在于：量子点分别为qds-525、qds-585、qds-625。

3.根据权利要求1所述的用于检测淋巴组织中b细胞亚群的试剂盒，其特征在于：包括量子点偶联抗体qds-585-cd19、量子点偶联抗体qds-525-cd138、量子点偶联抗体qds-525-cd1d、抗原修复液和dna荧光染液。

4.根据权利要求1-3中任一所述的用于检测淋巴组织中b细胞亚群的试剂盒，其特征在于：将量子点、edc、nhs以摩尔比1:2500-3500:5000-6000混合，对量子点进行活化，将抗体加入到活化量子点溶液中，量子点与抗体摩尔比为1:20-80，反应后得到qds-ab偶联物；取上清为能够用于染色的量子点标记的抗体溶液。

5.一种淋巴组织中b细胞亚群的检测方法，其特征在于：使用权利要求1-4中任一所述的试剂盒；通过不同量子点-抗体偶联物依次对淋巴组织切片中抗体cd19、抗体cd138和抗体cd1d的标记，实现对淋巴组织b细胞亚群的检测。

6.根据权利要求5所述的淋巴组织中b细胞亚群的检测方法，其特征在于：用于标记b细胞的特定抗体为cd19；用于标记浆细胞的特定抗体为cd19和cd138；用于标记调节b细胞的特定抗体为cd19和cd1d。

7.根据权利要求6所述的淋巴组织中b细胞亚群的检测方法，其特征在于：先制备淋巴组织切片，使用抗原修复液进行抗原修复，在分别使用不同量子点标记的抗体对组织切片进行染色，再对细胞进行染色，采集组织切片荧光信息，得知检测的淋巴组织中b细胞亚群组成情况。

8.权利要求5-7中任一所述的淋巴组织中b细胞亚群的检测方法在非疾病诊断治疗目的研究自身免疫性疾病状态中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：统计量子点荧光强度，计算对应抗体平均荧光强度；当cd19的平均荧光强度大于484.029，提示检测对象自身免疫状态亢进；同时cd138的平均荧光强度大于416.87，并且cd1d的平均荧光强度小于85.614，提示检测对象自身免疫亢进程度严重。

技术总结本发明涉及一种淋巴组织中B细胞亚群的检测方法，通过包括量子点‑抗体CD19偶联体、量子点‑抗体CD138偶联体和量子点‑抗体CD1d偶联体的试剂盒对淋巴组织切片染色，通过不同颜色的量子点对不同抗体的标记，实现对组织切片中B细胞，浆细胞和调节B细胞含量及位置的确认，便于明确其生物学行为。本发明方法对现有的多色免疫荧光技术进行了改进，使用量子点搭载抗体的方法，免去了二抗染色环节，采用直接法标记，并发挥量子点本身的优势，节省实验时间，提高效率。技术研发人员：张鹏,路超,李仕聪,李润泽,张鹏,张皓喆,张金霞,王欢受保护的技术使用者：天津医科大学总医院空港医院技术研发日：技术公布日：2025/1/13