一种用于靶向清除单增李斯特菌生物被膜的双载荷脂质体及其制备方法与应用

本发明属于微生物，尤其涉及一种用于靶向清除单增李斯特菌生物被膜的双载荷脂质体及其制备方法与应用。

背景技术：

1、致病微生物在食品接触表面形成生物被膜，造成交叉污染，并引发消费者食源性疾病感染或患者重复性感染和相关经济成本的大幅提升，已成为全球食品安全与公共卫生领域的严峻挑战。生物被膜是由微生物细胞分泌的蛋白、多糖或外源性dna等具有保护性和吸附性的多聚基质将其自身包裹而形成的结构性微生物群落，是菌体黏附在物体表面后为适应特定环境而构建的保护性生长策略。已形成的生物被膜还是其它多种致病菌及腐败微生物的藏身之处，菌落间的互感效应导致多种微生物协同共生，增加食品加工储运的再污染风险。此外，由于生物被膜的保护作用，菌体对不良刺激的耐受性提高，致使传统的杀菌和消毒方式不能有效清除致病菌生物被膜。因此，致病性生物被膜的有效防控是食品卫生行业的一大难题。

2、单增李斯特菌(listeria monocytogenes)是世界卫生组织定义的四大食源性致病菌之一，其能通过污染的食物进入人畜体内，引发脑膜炎、败血症、单核细胞增多和孕妇流产等症状，致死率可达20～30％。单增李斯特菌可黏附在食品或食品加工设备表面，形成生物被膜。一旦形成生物被膜，单增李斯特菌可在食品加工设备上存活10多年之久，严重影响食品安全性。因被膜态与浮游态单增李斯特菌在细胞结构和生物学特性上的差异，导致前者比后者抗性更强、危害更严重、且更难清除。一旦感染单增李斯特菌并形成生物被膜，常规光、热、紫外线、机械冲洗以及消毒剂处理等方法较难将其彻底清除。因此，研究新型、绿色、高效的单增李斯特菌生物被膜的防控方法及其作用机制对保证食品安全具有重要意义。

3、光动力学技术，是一种依赖于发生非热光物理和光化学反应来实现杀菌效果的技术，因其安全、环保、低能耗且多作用靶点的性质，已显示出有效抗菌和抗生物被膜的潜力。光动力学处理中，处于基态的光敏剂吸收所需波长的光跃迁至激发态进而发生一系列光化学反应，产生大量活性氧，增加微生物的细胞内氧化应激，从而导致细胞坏死和凋亡。脂质体是由磷脂分散于水相形成的双分子层结构囊泡，具有靶向性、控释性、细胞亲和性和组织相容性。脂质体中磷脂和生物被膜表面多聚物存在氢键作用，同时，特异性配体—受体的识别和相互作用，可用于脂质体的表面功能化，实现脂质体主动靶向传递。凝集素具有细胞黏附特性，可与生物被膜中的葡萄糖胺特异性结合。基于凝集素的特异性糖结合效应，在脂质体上连接凝集素，能实现脂质体主动靶向性单增李斯特菌生物被膜的目标，并能提高生物被膜表面的包埋物浓度。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种用于靶向清除单增李斯特菌生物被膜的双载荷脂质体的制备方法，所述制备方法如下：

2、(1)以1g∶0.05-0.1g∶0.1-0.25g：0.005-0.04g：0.008-0.01g的质量比称取大豆卵磷脂、胆固醇、吐温-80、抑菌剂、竹红菌乙素，完全溶解于45-55ml乙醇中，将溶液转移到旋转蒸发器中蒸发溶剂，直到形成均匀的膜，此后用90-110mlph 7.2、0.01mol/l的pbs水合干燥的脂质膜，最终pbs中大豆卵磷脂的质量浓度为9-11mg/ml，在冰浴条件下进行超声处理，以获得荷载抑菌剂和竹红菌乙素的双载荷脂质体；

3、(2)双载荷脂质体的表面功能化：向步骤(1)获得的双载荷脂质体中加入10-20mg/ml的唾液酸，搅拌后透析以除去未反应的唾液酸，再向脂质体溶液中加入等体积的凝集素溶液，搅拌后得到用于靶向清除单增李斯特菌生物被膜的双载荷脂质体。

4、优选地，所述步骤(1)中乙醇的体积为50ml。

5、更优选地，所述步骤(1)中pbs的体积为100ml。

6、更优选地，所述步骤(1)中最终pbs中大豆卵磷脂的质量浓度为10mg/ml。

7、更优选地，所述步骤(2)中脂质体溶液加入凝集素溶液后获得的混合溶液中凝集素的终浓度为0.4-0.5mg/ml。

8、更优选地，所述抑菌剂为香芹酚。

9、更优选地，所述凝集素为麦胚凝集素。

10、本发明以光敏剂和天抗菌剂为共同载荷制备双载荷脂质体，在特定波长光照下进行光动力处理实现单增李斯特菌生物被膜的清除，其中光敏剂为竹红菌乙素(采用波长为620-770nm的led光照射进行光动力处理，60mw/cm2，20-60min)，抗菌剂为香芹酚，脂质体采用大豆卵磷脂、胆固醇和吐温-80为原料制备获得。

11、本发明的目的之二在于提供一种由上述方法制备得到的双载荷脂质体。

12、本发明的目的之三在于提供上述双载荷脂质体在制备清除单增李斯特菌生物被膜产品中的用途。

13、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

14、(1)本发明实现了清除单增李斯特菌生物被膜作用的靶向性，具体参见实施例1-4中表面功能化凝集素的脂质体。靶向性是来源于脂质体表面功能化的凝集素，其具有细胞黏附特性，可与单增李斯特菌生物被膜的n-乙酰-d-葡萄糖胺特异性结合；单增李斯特菌分泌的具有穿孔效应的李斯特溶血素o能破坏脂质体的磷脂双层膜，在光动力学条件下释放出活性氧和抗菌剂，共同发挥清除单增李斯特菌生物被膜作用。此外，脂质体中磷脂和生物被膜表面多聚物存在氢键作用。

15、(2)本发明提高了清除单增李斯特菌生物被膜的有效性，实施例1-4中的脂质体载荷的抗菌剂和光敏剂均具有抑菌和抗生物被膜作用，脂质体脂双层在李斯特溶血素o的破坏下释放的光敏剂在光动力学作用下，吸收所需波长的光跃迁至激发态进而发生一系列光化学反应，产生大量活性氧，增加微生物的细胞内氧化应激，从而导致细胞坏死和凋亡，实现生物被膜的消除目的。

技术特征：

1.一种用于靶向清除单增李斯特菌生物被膜的双载荷脂质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中乙醇的体积为50ml。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中pbs的体积为100ml。

4.根据权利要求3中所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中最终pbs中大豆卵磷脂的质量浓度为10mg/ml。

5.根据权利要求4中所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中脂质体溶液加入凝集素溶液后获得的混合溶液中凝集素的终浓度为0.4-0.5mg/ml。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述抑菌剂为香芹酚。

7.根据权利要求6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述凝集素为麦胚凝集素。

8.由权利要求7所述的制备方法制备得到的用于靶向清除单增李斯特菌生物被膜的双载荷脂质体。

9.权利要求8所述的双载荷脂质体在制备清除单增李斯特菌生物被膜产品中的用途。

技术总结本发明公开了一种用于靶向清除单增李斯特菌生物被膜的双载荷脂质体及其制备方法与应用，属于微生物技术领域。本发明以光敏剂和天然抗菌剂为共同载荷制备双载荷脂质体，在特定波长光照下进行光动力处理实现单增李斯特菌生物被膜的清除，其中光敏剂为竹红菌乙素，采用波长为620‑770nm的LED光照射进行光动力处理，60mW/cm<supgt;2</supgt;，20‑60min，抗菌剂为香芹酚，脂质体采用大豆卵磷脂、胆固醇和吐温‑80为原料制备获得。该双载荷脂质体可高效清除单增李斯特菌的生物被膜。技术研发人员：蒲传奋,唐文婷,张洁,付泽月,王歆宇受保护的技术使用者：青岛农业大学技术研发日：技术公布日：2024/6/11