一种花生用抗病促生型复合微生物菌剂及其制备方法和应用

本发明属于微生物，具体涉及一种花生用抗病促生型复合微生物菌剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、花生为人们提供珍贵的食用油和蛋白质，是我国北方地区最主要的油料作物，在农业生产中占据不可或缺的位置。然而，随着种植模式和气候的变化，在花生的整个生育期，花生真菌病害严重威胁花生的产量与品质。

2、花生白绢病(sclerotium rolfsii)和花生基腐病(fusariumneocosmosporiellum)为花生土传性真菌病害，花生网斑病(phoma arachidicola)和花生轮斑病(alternaria alternata)为花生叶部病害。目前花生病害的防治主要依赖化学药剂——杀菌剂，但其大量使用严重影响人类健康和土壤微生物系统的平衡。拮抗微生物作为生防菌剂具有更好的环境友好性和可持续性，因此高效拮抗生防菌的筛选与应用成为研究的热点。

3、目前，在促进花生生长和防治花生病害方面的生防菌主要为真菌和细菌，例如联合接种缓生根瘤菌和木霉菌促进了花生生长并增加了产量(neelipally rtkr，anoruo ao，nelsons.effect of co-inoculation of bradyrhizobium and trichoderma on growth，development，and yield of arachis hypogaea l.(peanut)[j].agronomy,2020,10(9):1415)。黏质沙雷氏菌serew01能够抑制镰刀菌菌丝的生长和孢子萌发，以及伏马毒素的积累(guo zq,zhang x,wu jx,etal.in vitro inhibitory effeet of the bacteriumserratia marcescens on fusarium proliferatum growth and fumonisins production[j].biol contr,2020,143:104188)。在可控条件和大田条件下，哈茨木霉ct306和枯草芽孢杆菌ct104均能促进花生生长和提高花生抗病性(illa c,pérez aa，torassa m,etal.effect of biocontrol and promotion of peanut growth by inoculatingtrichoderma harzianum and bacillus subtilis under controlled conditions andfield[j].rev mex de fitopatología mex j phytopathol,2019,38(1):119-131.)。

4、然而目前的生防菌剂，针对性差，功能单一，且作用与土壤后，持续性和稳定性较差，往往需要多次施用，应用效果不佳。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种针对花生使用的复合型微生物菌剂，其具备抗病和促生双重功能，用量少且效果稳定，可作为功效型辅助菌剂使用。

2、为实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为：

3、一种花生用抗病促生型复合微生物菌剂，包含肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)、约氏不动杆菌(acinetobacter johnsonii)、绿针假单胞菌橘黄亚种(pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)。

4、进一步的，所述肺炎克雷伯氏菌的保藏编号为cgmcc no.1.12040，购自中国普通微生物保藏管理中心，原始保藏日期为2011年12月5日；所述约氏不动杆菌的保藏编号为cgmccno.1.15885，购自中国普通微生物保藏管理中心，原始保藏日期为2016年9月20日；所述绿针假单胞菌橘黄亚种的保藏编号为cgmcc no.1.4914，购自中国普通微生物保藏管理中心，原始保藏日期为2005年10月20日。本发明所用三种菌株均可通过中国普通微生物保藏管理中心菌种目录中查询公开购买，因此无需进行重复生物保藏。

5、一种花生用抗病促生型复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

6、s1混合菌液制备：将肺炎克雷伯氏菌、约氏不动杆菌、绿针假单胞菌橘黄亚种解冻后分别在lb固体培养基中活化，然后分别挑取单菌落接种到lb液体培养基中，28-30℃、180-200r/min培养至od600＝0.8得到种子液，将种子液均按照1％的量接种到200mllb液体培养基中28-30℃、180-200r/min培养，利用稀释涂布平板法检测菌液菌落活性数，达到1×108cfu·ml-1后结束培养，用无菌pbs缓冲溶液将其洗涤3次后重悬，得到三种菌悬液，将三种菌悬液按照体积比1:1:1混合后得到混合菌液；

7、s2微生物菌剂制备：将10gpva置于100ml蒸馏水中，充分溶解后高压灭菌，取出后待其冷却至室温，加入3g海藻酸钠，在室温下搅拌使其溶解充分得到混合液a；向混合液a中加入沸石粉，同时持续搅拌下滴加混合菌液、质量浓度为2％cacl2的饱和硼酸溶液，滴加完成后静置反应固化24h，得到固体用灭菌磷酸缓冲液洗涤2-3次，干燥后即得到微生物菌剂。

8、进一步的，步骤s1各菌株活化的方法为：将菌株解冻后接种lb固体培养基上，并在28-30℃下培养20-24小时即可。

9、进一步的，lb液体培养基的组成为：水1l，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，于容器中共混，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/l的naoh调ph至7.0，得lb液体培养基；lb固体培养基：于上述液体培养基中加入20g琼脂，得lb固体培养基。

10、进一步的，步骤s2中，混合液a、混合菌液、质量浓度为2％cacl2的饱和硼酸溶液以及沸石粉的固液比为50ml：30ml：50ml：100g。

11、一种花生用抗病促生型复合微生物菌剂的应用，微生物菌剂用于促进花生生长，并有效防治花生白绢病、基腐病、网斑病和轮斑病。

12、进一步的，微生物菌剂用于防治花生白绢病。

13、有益效果

14、(1)本发明筛选三株抗病促生型微生物菌株，三种菌株对花生多种真菌病害均具有拮抗作用，可以防治花生白绢病、基腐病、网斑病和轮斑病，特别对于花生白绢病病原菌抑制效果最佳；同时，保藏编号为cgmcc no.1.12040的肺炎克雷伯氏菌，其具有生物固氮以及产大量植物生长素iaa的作用；保藏编编号为cgmcc no.1.15885的约氏不动杆菌具有溶磷作用，同时可以拮抗多种植物病害；保藏编号为cgmcc no.1.4914的绿针假单胞菌橘黄亚种不仅具有拮抗病原菌的作用，其可以分泌多种活性物质，具有产吲哚、铁载体等的作用；三种菌株等比例混合后，协同配合，抗病促生作用显著，特别在生长过程中提升根系防御酶活性，从根本上提升作物抗性；

15、(2)本发明使用有机无机复合载体，在有机材料包覆固定微生物的同时将其负载于沸石中，在有效固定微生物的同时，可以修饰沸石内部孔隙结构，有效形成海绵状的多孔结构，实现对于微生物的有效负载，同时微生物的分泌的活性物质也可以得到有效的缓释，提升菌剂作用的持久性和稳定性；

16、(3)本发明微生物菌剂，配合常规施肥使用，减少化学杀菌剂的使用，有效抑制花生常见病原菌的生长，提升花生产量和品质，经济和社会效益显著。