一种核酸分子在提高芽孢杆菌芽孢生成率中的应用的制作方法

本发明涉及微生物基因工程技术和微生物发酵生产领域，具体地说，涉及到一种非编码rna基因及其产物（rna）的应用。

背景技术：

1、芽孢杆菌的芽孢是一种特殊的生命形式，具有极高的抗逆性和生存能力。这一特性使得芽孢杆菌在农业和环境保护等领域有着广泛的应用。

2、在农业领域，芽孢杆菌可以作为生物农药和生物肥料使用。生物农药和生物肥料是由微生物产生的具有特定功能的物质，可以防治农作物病虫害、提高农作物产量和改善土壤质量等。相较于传统的化学农药和化肥，生物农药和生物肥料对环境友好，对人体无害，不会产生抗药性和残留等问题。

3、在环境保护领域，芽孢杆菌可以用于污染物的生物降解和污水处理等方面。芽孢杆菌可以降解多种有机污染物和重金属离子，如苯酚、染料、农药和汞等，将它们转化为无害的物质。同时，芽孢杆菌还可以用于污水处理，将污水中的有机物分解为二氧化碳和水，降低污水中的污染物质含量。

4、由于芽孢具有很高的逆境耐受性，因此相比于营养体细胞，在存储、运输、使用等方面都具有很大的优势，所以很多芽孢杆菌制剂都以芽孢作为最终的产品形式。在生产过程中，高芽孢生产率无疑能够提高产量，扩大收益，但是目前芽孢生产仍存在以下制约因素：

5、生产效率低：目前生产芽孢的方法主要是通过固态或液态发酵，生产周期长，且产量相对较低。这主要是因为芽孢形成的机制复杂，需要特定的生长条件和营养物质，以及细胞内多种基因的协同作用。

6、培养条件要求高：芽孢杆菌的生长和芽孢形成过程中，需要严格控制温度、湿度、ph值等环境条件。如果条件不适宜，可能会导致产量下降或质量不稳定，从而影响其应用效果。

7、生产成本较高：由于芽孢杆菌生长和芽孢形成所需营养物质较为复杂，以及发酵设备、能源消耗、人力成本等因素，导致生产芽孢的成本较高，这也限制了芽孢杆菌在某些领域的应用。

8、工业化生产难度大：由于芽孢杆菌的芽孢形成机制较为复杂，生产过程中易受多种因素影响，因此工业化生产难度较大。目前市场上销售的芽孢产品多数是小规模实验室或研究机构自行制备的，规模化和标准化程度较低。

9、缺乏标准化和质量控制：由于不同菌种、不同生长条件下芽孢杆菌的芽孢产量和质量存在差异，缺乏统一的标准和质量控制体系，导致市场上的芽孢产品良莠不齐，给使用者带来一定的风险。

10、综上所述，目前芽孢生产的问题主要表现在生产效率低、培养条件要求高、生产成本较高、工业化生产难度大以及缺乏标准化和质量控制等方面。为了提高芽孢杆菌的应用范围和效果，需要加强技术创新和研发力度，优化生产工艺，提高芽孢生产效率和质量稳定性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，使用了一种非编码基因（dna）及其产物（非编码rna），来提高芽孢杆菌芽孢生成的效率。

2、除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语都具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

3、本发明所采用的技术方案包括以下步骤：构建所述基因的过表达质粒；转化所述基因过表达质粒到芽孢杆菌中；检测转入所述基因的芽孢杆菌的芽孢生成效率。

4、本发明所使用的核酸分子(基因)来源自瓦雷兹芽孢杆菌（ b. velezensis）fzb42，其序列如seq id no.1所示，该基因在fzb42基因组中的位置如图1所示，位于 phopr基因的3’-utr区。在本发明中，将这一基因命名为 phos，将其转录产物（非编码rna）对应命名为phos。

5、需要说明的是，上述的 phos基因可以是来源于任何具有 phos基因的细菌，包括但并不限于下述与瓦雷兹芽孢杆菌fzb42的 phos核心区相似性超过50%的近缘芽孢杆菌： bacillus pumilus、bacillus subtilis、bacillus mycoides、bacillus cereus、bacillus  licheniformis、bacillus thuringiensis、bacillus luti、bacillus tropicus、bacillus  toyonensis、bacillus pseudomycoides、bacillus gaemokensis和 bacillus  bingmayongensis等，这些芽孢杆菌的序列如图2所示

6、所述构建 phos基因过表达质粒的方法为：通过pcr扩增 phos基因，通过无缝克隆将 phos基因连于p spac启动子后，即为 phos过表达质粒。

7、所述转化 phos基因过表达质粒到芽孢杆菌中的方法为：通过化学转化法将 phos基因过表达质粒转化到芽孢杆菌中，再经菌落pcr，测序验证，确定 phos基因过表达质粒转入到芽孢杆菌中。所述pcr引物如下所示：fbo96: gaaccccttcatccaaggagcfbo97:aaagttcaatttgaaagg

8、所述检测转入 phos基因的芽孢杆菌芽孢的产量方法为：芽孢杆菌分别携带空载体（仅含phos基因的terminator）（图3）和 phos基因组成型表达质粒（图4），过夜震荡培养之后，取相同的菌液生长在对应抗生素lb固体培养基上，收集大小相近的菌落经反复涡旋和吹打，染色后在显微镜下观察；取1ml摇培后菌液，进行85℃热处理10min，10倍梯度稀释，取相同菌液滴加在lb固体平板上培养12h，定量芽孢形成。

9、相比于现在技术，本发明的有益效果为；通过基因工程技术，将促进基因芽孢生成的基因 phos，在芽孢杆菌中过表达。

10、本发明过表达 phos基因的芽孢杆菌，与含有空载体的芽孢杆菌相比，芽孢形成能力大大提高。

技术特征：

1.一种核酸分子（dna和转录对应的rna）在生产包含芽孢的生物制品中的应用，其特征在于，所述dna序列如seq id no.1所示，其核心区序列如seq id no.3所示；所述rna序列如seq id no.2所示，其核心区序列如seq id no.4所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脱氧核糖核酸分子（dna）含有核心序列如seq id no.2所示，所述核糖核酸分子（rna）含有核心序列seq id no.4所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核酸分子的长度为50-100 个核苷酸。

4.一种核酸分子（dna和转录对应的rna）在生产包含芽孢的生物制品中的应用，其特征在于，所述核酸分子与权利要求1中核酸分子（dna和rna）的序列相似性超过50%。

5.一种核酸分子（dna和转录对应的rna）在生产包含芽孢的生物制品中的应用，，其特征在于，所述核酸分子对应的核心区与权利要求1中核酸分子（dna和rna）的核心区序列相似性超过50%。

6.一种提高芽孢生产率的方法，其特征在于，通过某种组成型或者强启动子过表达权利要求1所述的核酸分子。

7.一种核酸载体在生产包含芽孢的生物制品中的应用，其特征在于，所述载体含有权利要求1、4或5所述的核酸分子。

8.一种重组细胞在生产包含芽孢的生物制品中的应用，其特征在于，所述细胞含有权利要求1、4或5所述的核酸分子，或者含有权利要求7所述的重组载体。

技术总结本发明公开了一种核酸分子（DNA和转录对应的RNA）在提高芽孢杆菌芽孢生成率中的应用，涉及微生物基因工程技术和微生物发酵生产领域。本发明公开的脱氧核糖核酸分子（DNA）及其转录成的核糖核酸分子（RNA）序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明公开的核酸分子，在过量表达情况下，能够使枯草芽孢杆菌生成芽孢的能力提高了约600倍，为芽孢相关生物制品的生产提供了一种新的思路或策略。技术研发人员：樊奔,陈若夫受保护的技术使用者：肖月婷技术研发日：技术公布日：2024/6/18