一种日本鳗鲡心脏组织细胞系及其制备方法和应用

本发明属于鱼类细胞培养，具体是涉及一种日本鳗鲡心脏组织细胞系及其制备方法和应用。

背景技术：

1、日本鳗鲡(anguilla japonica)是一种隶属于鳗鲡科(anguidae)、鳗鲡属(anguilla)的鱼类，是我国重要的经济鱼种。2022年我国鳗鲡总产量达28.17万吨，产值近百亿元，在我国农产品出口贸易中占有重要地位(2023中国渔业统计年鉴)。随着鳗鲡养殖产业的迅速发展，养殖密度不断增大，单位养殖面积的产量明显提高。近年来，鳗鲡养殖过程中常出现细菌性和病毒性疾病，尤其是鳗弧菌(vibrio anguillarum)、迟钝爱德华氏菌(edwardsirosis tarda)和鳗鲡疱疹病毒(anguillid herpesvirus，anghv)，给养殖者造成巨大的经济损失。因此对鳗鲡的免疫系统和抗病机制的研究迫在眉睫。嗜水气单胞菌感染鳗鲡后，心脏中心肌细胞孔空泡化，心肌纤维浑浊肿胀，颗粒变性，心肌横纹模糊不清。心脏组织中也可检测到鳗鲡疱疹病毒。因此分离日本鳗鲡心脏组织细胞并培养细胞系，将有助于进行以日本鳗鲡病原致病机制及免疫相关基因功能的研究。

2、细胞培养技术是生物学研究的重要技术，其主要是指从生物体内取出组织或细胞，在体外适当的条件下，使之存活、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。细胞模型具有可以减少实验动物数量、可重复性强、减少体内复杂因素影响等优点，随着细胞分离及培养技术的逐步完善，鱼类细胞系在病毒学、毒理学、免疫学及生理学等方面均有广泛应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种日本鳗鲡心脏组织细胞系及其制备方法和应用，所筛选保藏的细胞系传代稳定、存活率高，为日本鳗鲡的免疫应答机制研究提供可靠工具。

2、一种日本鳗鲡心脏组织细胞系的制备方法，包括如下步骤：

3、1)日本鳗鲡组织的获取：

4、日本鳗鲡在用4％的高锰酸钾消毒过的鱼缸中静养24h后，用乌来糖麻醉，于超净工作台中进行解剖，解剖前将剪刀用酒精擦拭，取出心脏组织并浸泡于双抗(gibco，15140-122)中，浸泡5～10min。

5、2)原代培养：

6、将通过步骤1)处理后的心脏组织剪成约1mm3左右的组织块，用pbs缓冲液漂洗5次，将组织块放进25cm2细胞培养瓶中，组织块需间隔5mm左右，加入500μl胎牛血清(gibco，10099-141c)，于培养箱(28±2℃，5％ co2)中倒置6h后正置细胞培养瓶，4天后加入原代培养基，每天观察是否有细胞迁出或细菌及真菌的污染。

7、在步骤2)中，所述原代培养基为以dmem/f-12(hyclone，sh30023.01)为基础培养基，包括终浓度分别为20％胎牛血清fbs，1％～2％双抗，20ng/ml fgf(portertech，450-33)。

8、3)传代培养：

9、原代培养至迁出细胞铺满培养瓶底板的80％左右时，吸走原代培养基，并用pbs清洗除去多余的血清，然后用0.25％的胰蛋白酶(gibco，15050057)消化贴壁细胞，在传代培养基中进行传代培养获得日本鳗鲡心脏组织细胞系。

10、在步骤3)中，所述传代培养基以dmem/f-12为基础培养基，包括终浓度分别为15％胎牛血清fbs，2％双抗，20ng/ml fgf，于5％ co2培养箱中，28℃±2℃培养。

11、本发明提供日本鳗鲡心脏细胞系ajh(angui11d japonica)，由上述日本鳗鲡心脏组织细胞系的制备方法构建后获得，于2024年3月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为武汉大学，保藏中心编号为cctcc no：c202458。

12、本发明提供所述日本鳗鲡心脏组织细胞系在制备分离和增殖鳗鲡疱疹病毒(anguillad herpesvirus，anghv)试剂中的应用。

13、本发明所提供的日本鳗鲡心脏细胞系可用于免疫应答机制研究。经lps刺激后，ajtnf-α及ajil-iβ的表达水平明显上调；转染poly i:c后，ajrig-ia、ajrig-ib的表达水平明显上调。在双荧光素酶报告系统中，共转染ajirf1和ajifns启动子后，显示ajirf1可显著上调启动子活性。

14、所述日本鳗鲡心脏细胞系可在制备免疫相关产品中应用。

15、本发明提供一种日本鳗鲡心脏组织细胞ajh(angui11d japonica)。本发明所提供的日本鳗鲡心脏组织细胞系可连续传代，实验结果表明传至60代并保持稳定，能够提供大量稳定的日本鳗鲡心脏细胞，用于免疫功能基因的研究等。所提供的细胞系形状优良，为成纤维细胞，细胞呈梭形，胞体向外延伸出几个不规则突起，细胞间排列紧密。4-5传代一次，复苏效率高，可用于分离和增殖鳗鲡疱疹病毒，并可进行质粒转染、双荧光素酶报告系统等多类分子生物学实验。

技术特征：

1.日本鳗鲡心脏细胞系，其特征在于：已于2024年3月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心编号为cctcc no：c202458，命名为日本鳗鲡心脏细胞系ajh。

2.一种日本鳗鲡心脏组织细胞系的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

3.如权利要求2所述一种日本鳗鲡心脏组织细胞系的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述原代培养基为以dmem/f-12为基础培养基，包括终浓度分别为20％胎牛血清fbs，1％～2％双抗，20ng/ml fgf，于5％co2培养箱中，28℃培养。

4.如权利要求2所述一种日本鳗鲡心脏组织细胞系的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述传代培养基以dmem/f-12为基础培养基，包括终浓度分别为15％胎牛血清fbs，2％双抗，20ng/ml fgf，于5％co2培养箱中，28℃培养。

5.如权利要求1所述日本鳗鲡心脏细胞系在制备分离和增殖鳗鲡疱疹病毒试剂中的应用。

6.如权利要求1所述日本鳗鲡心脏细胞系用于免疫应答机制研究。

7.如权利要求1所述日本鳗鲡心脏细胞系在制备免疫相关产品中的应用。

技术总结一种日本鳗鲡心脏组织细胞系及其制备方法和应用，属于鱼类细胞培养技术领域。所筛选保藏的细胞系传代稳定、存活率高，为日本鳗鲡的免疫应答机制研究提供可靠工具。日本鳗鲡心脏细胞系AJH保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：C202458。提供所述日本鳗鲡心脏组织细胞系在制备分离和增殖鳗鲡疱疹病毒试剂中的应用。提供的日本鳗鲡心脏细胞系可用于免疫应答机制研究。可用于分离和增殖鳗鲡疱疹病毒，并可进行质粒转染、双荧光素酶报告系统等多类分子生物学实验。技术研发人员：黄贝,周晓玲,李东利,熊静,黄文树受保护的技术使用者：集美大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18