一种蓝莓原生质体瞬时转化的方法

本发明属于生物，具体涉及一种蓝莓原生质体瞬时转化的方法。

背景技术：

1、蓝莓为杜鹃花科(ericaceae)越橘属(vaccinium)的小浆果类灌木，其果实富含花青素，具有极高的保健价值，在延缓衰老、减少神经退行性病变等方面具有一定的作用。蓝莓对干旱、盐碱等非生物胁迫较为敏感，其栽培与生产也因此受到严重的影响。目前，蓝莓自身抗逆机理还未被完全解析。应用生物技术解析蓝莓响应逆境的分子机制，可以为蓝莓栽培上非生物胁迫问题的解决和技术开发提供新的可靠方向。

2、研究蓝莓响应逆境的功能基因与花青素调控的基因，是解析其抗逆机理以及提升花青素含量的重要切入点，包括基因表达模式、转录水平调控、翻译后修饰等方面，而相关研究需要通过目标基因在植物体内高效、稳定的表达来实现。植物原生质体是去除细胞壁后的植物细胞，仍保留原来细胞的活力与特性。通过将携带目标基因的外源质粒转化蓝莓原生质体，可以得到目的基因及其编码蛋白在蓝莓自身细胞内的表达模式，探究其与其他基因或蛋白的互作机制，从而更快更精准地研究其在分子层面上的功能。

技术实现思路

1、本发明所要解决的主要问题是如何制备蓝莓原生质体，并使蓝莓原生质体高效表达外源基因。

2、为了解决上述问题，本发明提供了一种蓝莓原生质体的瞬时转化方法。

3、本发明提供的一种蓝莓原生质体的瞬时转化方法，所述方法包括如下步骤：

4、1)转化：将质粒/ca2+溶液与蓝莓原生质体悬浮液混合形成孵育液，随后加入peg溶液，混匀得到孵育混合物；

5、2)培养：在所述孵育混合物中加入w5溶液终止反应，离心收集沉淀，再加入wi溶液，遮光培养，完成蓝莓原生质体的转化；

6、其中步骤1)中所述蓝莓原生质体的制备方法可为如下：

7、a1)酶裂解：将蓝莓叶片或果实诱导出的愈伤组织作为酶解反应底物，通过酶解体系制备原生质体细胞；

8、所述酶解体系的组成为：yakult纤维素酶r-10(1.2％,w/v)、yakult离析酶r-10(0.8％,w/v)、kcl(0.15％,w/v)、cacl2·2h2o(0.14％,w/v)、mes(0.43％,w/v)、甘露醇(9.1％,w/v)、bsa(0.15％,w/v)，余量为水；

9、a2)分离：将步骤a1)反应体系中加入w5溶液，随后过滤大块杂质，获得原生质体悬浮液；

10、a3)纯化：将步骤2)所述的原生质体悬浮液与甘露醇溶液和蔗糖溶液混合，离心使三者分层，收集中间层细胞，并采用mmg溶液进行二次纯化，离心，收集离心后的沉淀为所述蓝莓原生质体。

11、上述转化方法中，所述质粒/ca2+溶液由质粒和cacl2溶液组成，二者体积比为1:4。cacl2溶液中ca2+的使用浓度为0.5-0.6mol/l；质粒使用浓度为2.5-3.5μg/μl。

12、上述转化方法中，所述蓝莓原生质体悬浮液(单位：μl)与所述质粒/ca2+溶液(单位：μl)配比为2:1到3:1之间，所述孵育液由二者混合形成。同时转化两种质粒时，两种质粒的摩尔数之比为1:1。

13、上述转化方法中，所述peg溶液中含有peg(48％,w/v)、甘露醇(5.46％,w/v)，所述peg溶液(单位：μl)与所述孵育液(单位：μl)配比为1:1。

14、上述转化方法中，所述w5溶液的组成为：mes浓度2mmol/l、nacl浓度154mmol/l、cacl2浓度150mmol/l、kcl浓度10mmol/l，余量为水。

15、上述转化方法中，步骤2)中所述遮光培养为25℃避光静置培养16h。

16、上述转化方法中，所述蓝莓原生质体的制备方法中，a1)所述酶解体系反应条件为：室温避光酶解5h。

17、在一个具体的实施例中，所述蓝莓原生质体的瞬时转化方法可为如下：

18、(1)将蓝莓叶片或果实诱导出的愈伤组织作为酶解反应底物，通过酶解体系分离原生质体细胞。

19、所述蓝莓品种可为半高丛蓝莓‘北陆’或兔眼蓝莓‘灿烂’，所述半高丛蓝莓‘北陆’由叶片诱导愈伤组织，所述兔眼蓝莓‘灿烂’由果实诱导。

20、所述蓝莓愈伤组织接种于固体培养基，继代周期为35-40天。

21、所述固体培养基组分包括：wpm(1.991g/l)、蔗糖(30g/l)、琼脂(6.4g/l)、2,4-d(1.5mg/l)、6-ba(0.4mg/l)，并使用koh将ph值调整至5.2-5.5。

22、所述愈伤组织需要培养成长宽1cm左右的团块，团块外围呈乳白色或淡黄色，略呈透明状。

23、(2)收集步骤(1)中分离得到的原生质体，并使其密度达到2×105个/ml。

24、(3)进行待转化质粒抽提，并用ph值为8.0的te buffer溶解质粒，使待转化质粒浓度大于等于2500ng/μl，所述转化质粒纯度须要a260/a280比值在1.85-1.95之间，a260/a230比值在2.2-2.4之间。

25、(4)将步骤(3)所述质粒与cacl2溶液混匀形成质粒/ca2+溶液，室温静置10min。

26、(5)使用步骤(2)所述的原生质体细胞悬液和步骤(4)所述的质粒/ca2+溶液，将二者按比例混合后静置15min，随后按比例加入peg溶液混匀，室温反应35min。

27、(6)到预定时间后，加入等体积的w5溶液以停止反应。随后离心收集细胞，去除上清液后再加入1ml的w5溶液，离心后吸去上清液。离心条件包括：离心力100g；离心时间3min。

28、(7)加入2ml的wi孵育液重悬细胞，25℃避光静置培养16h。在激光共聚焦显微镜下进行检测。

29、本发明还提供了一种蓝莓原生质体的制备方法，包含如下步骤：

30、a1)酶裂解：将蓝莓叶片或果实诱导出的愈伤组织作为酶解反应底物，通过酶解体系进行酶解反应；

31、所述酶解体系的组成为：yakult纤维素酶r-10(1.2％,w/v)、yakult离析酶r-10(0.8％,w/v)、kcl(0.15％,w/v)、cacl2·2h2o(0.14％,w/v)、mes(0.43％,w/v)、甘露醇(9.1％,w/v)、bsa(0.15％,w/v)，余量为水；

32、a2)分离：向步骤a1)酶解反应液中加入w5溶液，随后用细胞筛过滤大块杂质，获得原生质体悬浮液；

33、a3)纯化：将步骤2)所述原生质体悬浮液与甘露醇溶液和蔗糖溶液混合，离心使三者分层，收集中间层细胞，并采用mmg溶液进行二次纯化，离心，收集离心后的沉淀为所述蓝莓原生质体。

34、本发明中，所述w5溶液是一个盐溶液系统，包含多种盐组分以营造合适的胞外环境，从而维持质膜稳定。w5溶液组分可包括：nacl(0.9％,w/v)、cacl2·2h2o(2.2％,w/v)、kcl(0.075％,w/v)、mes(0.043％,w/v)。以上各组分使用去离子水溶解，同时用koh调节ph值至5.6。

35、所述mmg溶液为mg2+重悬液，其提供的mg2+作为一种二价金属阳离子，能够改变细胞膜透性使其更易摄取外源遗传物质，同时可以与核酸结合以协助其转化。mmg溶液组分包括：mgcl2(0.14％,w/v)、甘露醇(9.1％,w/v)、mes(0.085％,w/v)。以上各组分使用去离子水溶解，同时用koh调节ph值至5.7。

36、所述peg溶液包括peg(48％,w/v)、甘露醇(5.46％,w/v)。使用去离子水溶解。

37、所述wi溶液为原生质体孵育液，用于长时间贮存并培养转化后的原生质体细胞。组分包括：kcl(0.15％,w/v)、甘露醇(10％,w/v)、mes(0.085％,w/v)。以上各组分使用去离子水溶解，同时用koh调节ph值至5.6。

38、本发明还提供了上述蓝莓原生质体的瞬时转化方法和/或蓝莓原生质体制备方法在基因功能验证、基因表达调控、蛋白亚细胞定位、信号转导、rna干扰和/或基因编辑中的应用。

39、采用本发明所提出的蓝莓原生质体瞬时转化反应体系，可以实现外源遗传物质在蓝莓本体细胞中的表达，转化效率达到30％，使蓝莓在细胞层面上的基因表达研究成为可能，为构建其稳定且精准的基因表达系统提供了技术支撑。