一种基于微流控芯片的干细胞控氧分化方法

本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种基于微流控芯片的干细胞控氧分化方法。

背景技术：

1、干细胞是具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞，如脂肪细胞、神经细胞和心肌细胞等。干细胞及其衍生物在机制研究、疾病建模以及药物筛选上有着广泛的应用。因为人干细胞及其衍生物与动物模型相比，不会存在着种属差异所带来的问题，相比于人原代细胞，也没有来源不稳定、难以冻存及无法扩增的缺点。尽管使用人类干细胞分化而来的脂肪细胞用于相关研究是非常有潜力的，但目前干细胞衍生的脂肪细胞存在着分化率低、表型不完全成熟的问题，究其原因，这很大程度上是由于体外干细胞发育的微环境不合适。

2、解决这一问题的关键在于合理操控分化过程的干细胞微环境。而氧气作为微环境的成分之一，其不仅仅是维持细胞生物能量和新陈代谢的燃料，而且还是调节细胞命运的重要信号。目前已有些许研究阐述了低氧/体内生理氧条件对干细胞分化的影响，但尚无研究报导微环境中不同氧浓度以及变化的氧浓度对干细胞分化的影响。因此，开发一种干细胞控氧分化方法，是了解氧气影响干细胞分化以及提高分化率的重要基础。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种基于微流控芯片的干细胞控氧分化方法，通过构建微流控芯片，控制控氧室的氧浓度，实现干细胞的控氧分化，并对分化过程的细胞进行检测，明确了氧浓度对干细胞分化的影响，并通过改变氧浓度去影响干细胞的分化。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供了基于微流控芯片的干细胞控氧分化方法，包括如下步骤：

3、s1.构建微流控芯片，所述微流控芯片包括控氧腔室和细胞培养腔室，所述控氧腔室和细胞培养腔室之间通过透气不透液的薄膜隔绝；

4、s2.向细胞培养腔室加入干细胞和培养基，控制控氧腔室的氧浓度，实现干细胞的控氧分化。

5、进一步的，对分化的细胞进行检测。

6、本发明通过构建微流控芯片，在微控流芯片中配置控氧腔室和细胞培养腔室，控制控氧腔室的氧浓度，利用控氧腔室和细胞培养腔室透气不透液薄膜实现两腔室中气体交换，进而控制细胞培养腔室内的氧浓度，实现干细胞在控氧条件下分化，并对分化过程中的细胞进行检测，明确氧浓度对干细胞分化的影响。

7、进一步的，所述微流控芯片包括从上到下依次顺序设置的盖板、第一腔室层、透气不透液薄膜、第二腔室层、底板，所述第一腔室层设置呈阵列排列的细胞培养腔室，所述第二腔室层设置呈阵列排列的控氧腔室，所述第一腔室层和第二腔室层上设置黏合胶实现层间连接和密封，通过盖板和底板实现两腔室与外界环境的隔绝；所述控氧腔室和细胞培养腔室上下正对设置，通过透气不透液薄膜实现气体交换，优选的，每行所述控氧腔室之间连通。

8、进一步的，所述第一腔室层、第二腔室层和底板的材质为pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)，气密性良好且透光率极高。

9、进一步的，所述盖板和薄膜的材质为pdms(聚二甲基硅氧烷)，所述盖板的厚度为2mm，可阻滞环境气体的同时允许微型氧传感器的探针穿过，从而实现氧浓度的实时监测，所述薄膜的厚度为50μm，可实现两腔室透气。

10、进一步的，微流控芯片的构建方法为：

11、(1)设计完微流控芯片的3d结构后，将每层部件的二维结构图导出为ai文件，上层和中间层部件文件内均设置有腔室，底层无任何腔室或通道；

12、(2)按照不同层的各部件文件，将pmma板块切割，获得若干个不同结构的层部件，即第一腔室层、第二腔室层和底板；

13、(3)将各层部件清理后，与pdms薄膜和盖板组装成完整的阵列微流控芯片。

14、进一步的，s2前，对微流控芯片清洗并置于高温条件热烘并紫外除菌。

15、进一步的，s2中，在无菌条件下向细胞培养腔室加入干细胞和培养基。

16、进一步的，s2中，干细胞分化为脂肪细胞、神经细胞或心肌细胞。

17、进一步的，s2中，分化时所述培养基每2-3天更换一次。

18、进一步的，s2中，分化为脂肪细胞时，所述培养基包括生长培养基和诱导培养基，起始加入生长培养基，在干细胞的密度为75-85％时，将生长培养基更换为诱导培养基，诱导分化3-4周。

19、进一步的，所述脂肪细胞的诱导培养基包括：100-500μm 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1-10μg/ml胰岛素、1-10μm地塞米松、100-200μm吲哚美辛，余量为质量比为9:1的dmem培养基(含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)和血清，优选的，所述血清为fbs(胎牛血清)。

20、进一步的，s2中，分化为神经细胞时，所述培养基包括neurobasa l培养基(神经细胞培养基)和神经诱导添加剂，诱导分化1周。

21、进一步的，s2中，分化为心肌细胞时，所述培养基包括pgm1(葡萄糖磷酸变位酶1)培养基和ch i r99021(6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1h-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈)的1640/b27-培养基，在pgm1培养基培养至融合度达90％，将培养基替换为ch i r99021的1640/b27-培养基，诱导分化2-3周。

22、进一步的，s2中，所述控氧腔室内注入微藻溶液，通过控制控氧腔室内微藻溶液的浓度及光照条件控制氧浓度，其中，微藻溶液的浓度为0.25-0.75x(1x＝2亿个/ml),光照条件为100-2000l ux，氧浓度为0.790-58.640％。

23、进一步的，s2中，在恒定的氧浓度条件下进行持续分化，或在不同分化阶段改变氧浓度。在恒定的氧浓度条件下进行持续分化，可以得出不同氧浓度对干细胞分化的影响；在不同分化阶段改变氧浓度，可以获得氧浓度对该分化阶段的影响。

24、进一步的，恒定的氧浓度条件为恒定的微藻浓度以及光照条件，不同分化阶段改变氧浓度指在不同分化阶段的时间点，更改微藻浓度以及光照条件。

25、本发明的有益效果：

26、本发明通过构建微流控芯片，将干细胞在控氧的微环境下条件下进行分化，并对分化的细胞进行检测，明确了氧浓度对干细胞分化的影响，可提高干细胞的分化效率，同时提供了一种利用氧气影响干细胞分化的方法；

27、本发明为干细胞组织工程提供了一种新的分化思路，可将干细胞在一定的氧浓度下进行长期的分化，或将干细胞在分化的不同阶段置于不同的氧浓度条件下进行分化，根据不同氧浓度条件下的分化结果，可以在不同时间点去改变氧浓度以影响干细胞的分化。

技术特征：

1.一种基于微流控芯片的干细胞控氧分化方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的基于微流控芯片的干细胞控氧分化方法，其特征在于，s2中，所述控氧腔室内注入微藻溶液，通过控制控氧腔室内微藻溶液的浓度及光照条件控制氧浓度。

3.如权利要求2所述的基于微流控芯片的干细胞控氧分化方法，其特征在于，所述微藻溶液的浓度为0.25-0.75x。

4.如权利要求2所述的基于微流控芯片的干细胞控氧分化方法，其特征在于，所述光照条件为100-2000lux。

5.如权利要求1所述的基于微流控芯片的干细胞控氧分化方法，其特征在于，s2中，所述氧浓度为0.79％-58.64％。

6.如权利要求1所述的基于微流控芯片的干细胞控氧分化方法，其特征在于，s2中，在恒定的氧浓度条件下进行持续分化，或在不同分化阶段改变氧浓度。

7.如权利要求1所述的基于微流控芯片的干细胞控氧分化方法，其特征在于，s2中，所述干细胞分化为脂肪细胞、神经细胞或心肌细胞。

8.如权利要求1所述的基于微流控芯片的干细胞控氧分化方法，其特征在于，s2中，分化时所述培养基每2-3天更换一次。

9.如权利要求1所述的基于微流控芯片的干细胞控氧分化方法，其特征在于，所述微流控芯片包括顺序叠层设置的盖板、第一腔室层、透气不透液薄膜、第二腔室层、底板，所述第一腔室层设置细胞培养腔室，所述第二腔室层设置控氧腔室，所述控氧腔室和细胞培养腔室上下正对设置。

10.如权利要求1所述的基于微流控芯片的干细胞控氧分化方法，其特征在于，所述薄膜的材质为聚二甲基硅氧烷。

技术总结本发明公开了一种基于微流控芯片的干细胞控氧分化方法，包括如下步骤：构建微流控芯片，所述微流控芯片包括控氧腔室和细胞培养腔室，所述控氧腔室和细胞培养腔室之间通过透气不透液的薄膜隔绝；向细胞培养腔室加入干细胞和培养基，通过控制控氧腔室来调控氧浓度，实现干细胞的控氧分化。本发明通过构建微流控芯片，将干细胞在控氧的微环境下条件下进行分化，并对分化的细胞进行检测，明确了氧浓度对干细胞分化的影响，可提高干细胞的分化效率，同时提供了一种利用氧气影响干细胞分化的方法。技术研发人员：张秀莉,阳又龙,刘远贵,罗勇受保护的技术使用者：苏州大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18